心脏神经重塑对心肌细胞瞬时外向钾电流的影响及其分子机制

论文摘要

心律失常大都受到心脏自主神经直接和间接的影响。越来越多的研究显示心脏交感和副交感神经功能紊乱是心律失常发生和维持的一个重要因素。心脏自主神经重塑（cardiac autonomic nerve remodeling,CANR）是指心脏由于某些疾患导致的自主神经的分布密度和空间排布的改变（主要表现为区域性神经分布密度增高或缺失,即去神经）,以及由此导致的自主神经功能改变。神经分布密度增高常由神经轴突再生（或称芽生）（axon regenernation or sprouting）引起,多见于器质性损伤（如心肌梗塞、心肌病）后的修复阶段。去神经的病因可见于许多心肌器质性病变,如心肌梗塞、糖尿病性自主神经病变、原发性室颤等。心率失常的发生有两个条件:一个是心脏解剖或功能的基础条件即“基质”（substrate）;另一个是触发因素（trigger）。但对于CANR如何导致致命性心律失常,其分子机制如何,目前仍不清楚,这方面的研究已成为心律失常领域的研究热点之一。瞬时外向钾电流（transient outward current,Ito）是一种心肌细胞复极化的重要电流,它对心肌细胞动作电位时程（action potential duration,APD）的影响重大。在啮齿类动物的心脏,由于Ito在心外膜、中层和心内膜层心肌组织的分布不同,从而造成心肌组织电生理特性明显的异质性。当某种病因引起Ito在心肌的这种异质分布出现变化时,就会引起心肌电异质性的增加,心室肌跨壁复极离散度增大,由此可诱发心律失常。心肌细胞的Ito通道中形成通道孔道的亚单位（α亚单位）由Kv1.4（编码Ito.s）、Kv4.2（啮齿类,编码Ito.f）或Kv4.3（犬科类,编码Ito.f）亚单位构成。电压门控钾通道相互作用蛋白2（Kv channel interacting protein 2,KChIP2）是一种在心肌组织中能和Kv4通道结合且能使之从胞浆转运到胞膜定位的蛋白质。在心肌组织,KChIP2的表达、功能变化会影响到心肌细胞的Ito电流密度,改变了心肌组织的电生理特性,从而成为心律失常的一个诱因。然而,心脏疾患（如心肌梗塞）引发的神经重塑是否对心肌细胞Ito的电流密度产生影响,以及这种影响的分子机制如何,目前并不清楚,这正是本研究要探讨的问题。本工作从整体、细胞和分子水平研究了心脏神经重塑对心肌细胞Ito电流密度的影响及对其分子机制。主要内容包括三部分:神经再生对Ito的影响;去神经对Ito的影响以及促离子型谷氨酸受体NMDAR与Ito的关系。在整体水平上,我们以内源性神经生长因子（nerve growth factor,NGF）合成刺激剂4-甲基邻苯二酚（4-MethyIcatechol,4-MC）诱导心交感神经芽生,建立了心脏神经芽生模型;用6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）化学杀伤心交感神经,建立了大鼠心脏去交感神经模型:利用经隔肌液氮冷冻损伤心肌的方法建立了模拟心肌梗塞（myocardial infarction,MI）模型。在这些模型的基础上,我们分别观察了心交感神经芽生以及心脏去神经对Ito的影响:分析了大鼠心肌组织Kv1.4、Kv4.2、KChIP2转录、蛋白表达的变化以及引起这些分子变化的信号通路（膜受体-ERK-CREB信号通路）。结果表明:1)心交感神经芽生和去神经都会导致心肌组织Ito电流密度降低,在心脏神经芽生合并MI时Ito电流密度进一步降低;2)心交感神经芽生和去神经都导致了心肌组织Kv4.2和KChIP2的表达降低,在神经芽生的心脏,合并MI时,二者的表达进一步下降;交感神经芽生对Kv1.4转录和蛋白的表达均没有明显影响,但在去神经的心脏Kv1.4蛋白的表达却出现了一定程度的降低;3)在心脏神经重塑引发这些分子变化的信号转导调控通路的研究上,我们分析了心脏ERK-CREB通路与Ito的关系。ERK/MAPK通路可调节心肌细胞的许多代谢过程,是一条重要的信号转导途径。磷酸化后的ERK,能将转录因子CREB丝氨酸133位点磷酸化,激活的CREB从胞浆移位到核内,与DNA上启动子区域中的cAMP反应元件位点结合,进而启动基因转录。已知ERK/MAPK通路可通过调节心肌细胞Ito的表达而影响心脏记忆。我们认为心交感神经芽生和心脏去神经可导致ERK/MAPK信号通路的改变,从而影响Ito。结果显示,心脏神经芽生和心脏去神经都导致了ERK/MAPK信号通路中ERK1/2的磷酸化和CREB的磷酸化程度降低,从而使CREB调控的KChIP2的转录、表达出现下调。我们研究室近来的研究发现,在MI修复期心肌细胞膜离子型谷氨酸受体（iGluRs）的表达出现了明显上调（待发表）。我们的研究以及他人研究显示,iGluRs在心肌有丰富表达。鉴于iGluRs在神经系统中的重要作用,我们推测离子型谷氨酸受体NMDAR很可能在心脏神经重塑与心律失常的关系中发挥一定作用。基于大鼠的整体实验结果,本项研究在培养心肌细胞研究中发现:1)NMDA 10-7-10-5mol/L均导致心肌细胞Ito电流密度剂量依赖性降低;2)NMDA 10-7-10-5mol/L导致心肌细胞Kv4.2及KChIP2的表达剂量依赖性地降低（P＜0.01）,但Kv1.4的变化不明显（P＞0.05）:3)激光共聚焦研究显示,当NMDA达到10-5mol/L时,Kv4.2蛋白向细胞膜的转运及定位出现障碍,部分散布在胞质中;4)NMDA(10-5mol/L)可引起心肌细胞内可逆性游离钙浓度的增加,同时可以激活ERK和CREB的活性,使pERK42/44和pCREB（Ser133和Ser142磷酸化）的水平增高,尤其pCREB（Ser142磷酸化）的水平升高更加明显。综合上述各部分结果,我们得出如下结论:1)心脏神经重塑（神经芽生和去神经）导致了心肌细胞膜Ito电流密度的降低,其降低的分子机制之一是钾通道的a亚单位Kv4.2及胞质内参与转运Kv4.2的KChIP2表达出现下调,导致Kv4.2从胞浆到膜的转运出现不同程度的障碍,使其不能顺利地在胞膜上功能性定位;2)心脏神经重塑（神经芽生和去神经）通过某种未知的上游信号导致ERK和CREB的磷酸化水平降低,使ERK—pCREB（Ser133）信号的激活程度降低,从而抑制了转录因子pCREB向核内转移,因而KChIP2表达降低:这一信号通路可能是:膜受体—ERK—CREB—KChIP2:3)心脏神经再生使NMDAR表达上调,后者的激活导致Ca2+—CaMKⅡ—pCREB（Ser142）信号通路激活,从而抑制pCREB（Ser133）与KChIP2基因上游调控序列（CRE）的结合,于是KChIP2表达下调,导致Kv4.2向膜的转运和定位发生障碍。这两条信号通路在调节KChIP2表达方面起着非常重要的相互反馈控制作用,而NMDAR表达增高后通过激活后一条通路,可能在心脏神经重塑诱发心律失常过程中扮演着重要角色。

论文目录

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