薯蓣皂苷糖苷酶基因表达的研究

论文摘要

本文主要研究薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母菌中的表达。将含有薯蓣皂苷糖苷酶基因的宿主菌大肠杆菌进行诱导培养,提取的菌体进行破壁、分离后得到表达产物,并对该表达产物进行酶活性检测和SDS-PAGE分析。对薯蓣皂苷葡萄糖苷酶基因进行真核亚克隆,构建重组表达质粒,经线性化和乙醇精制回收后电转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,然后进行PCR筛选阳性克隆。筛出的菌用BMGY培养基进行生长阶段的培养,然后换BMMY培养基进行诱导阶段的培养,此阶段加入甲醇作为诱导剂进行该基因的诱导表达,并对进行培养条件的优化实验和空白对照实验。研究结果表明,薯蓣皂苷糖苷酶基因在大肠杆菌中表达出的酶蛋白没有活性,而在巴斯德毕赤酵母表达出的酶蛋白经酶活性检测,发现具有薯蓣皂苷糖苷酶的活性,且培养的最佳提取时间为144 h、甲醇浓度为0.5%,在此基础上,经SDS-PAGE分析,确定其分子量为58 kDa,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 薯蓣皂苷概述
• 1.1.1 薯蓣植物概述
• 1.1.2 薯蓣皂苷的化学成分
• 1.1.3 薯蓣皂苷的药理作用
• 1.2 薯蓣皂苷糖苷酶
• 1.2.1 薯蓣皂苷转化生成薯蓣皂苷元的研究
• 1.2.2 薯蓣皂苷糖苷酶简介
• 1.2.3 薯蓣皂苷糖苷酶研究进展
• 1.3 外源基因在原核细胞中的表达
• 1.3.1 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 1.4 亚克隆
• 1.5 巴斯德毕赤酵母真核表达系统概述
• 1.5.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的构成
• 1.5.1.1 巴斯德毕赤酵母的表达载体
• 1.5.1.2 宿主菌
• 1.5.2 外源基因在毕赤酵母中的表达
• 1.5.2.1 外源基因在毕赤酵母中的表达的特点
• 1.6 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 薯蓣皂苷糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.1.1 培养基的选择
• 2.2.1.2 菌体的诱导
• 2.2.1.3 菌体的收集与处理
• 2.2.1.4 细胞破碎
• 2.2.1.5 转基因大肠杆菌产酶蛋白的提取
• 2.2.1.6 转基因大肠杆菌产酶蛋白的活性检测
• 2.2.1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白分子量
• 2.2.2 薯蓣皂苷糖苷酶基因的真核亚克隆
• 2.2.2.1 重组质粒的构建
• 2.2.2.2 转化及重组子的筛选
• 2.2.2.3 电转化与筛菌
• 2.2.3 薯蓣皂苷糖苷酶基因在毕赤酵母中的诱导表达
• 2.2.3.1 毕赤酵母的诱导培养
• 2.2.3.2 蛋白含量的测定
• 2.2.3.3 转基因毕赤酵母产酶蛋白的提取
• 2.2.3.4 转基因毕赤酵母产酶蛋白的活性测定
• 2.2.3.5 转基因毕赤酵母产酶蛋白的分子量测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 薯蓣皂苷糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 大肠杆菌培养基的选择
• 3.1.2 菌体生长状况的确定
• 3.1.3 菌体破碎方法的确定
• 3.1.3.1 超声波破碎方法的优化
• 3.1.4 转基因大肠杆菌产酶蛋白的活性检测
• 3.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白分子量
• 3.2 薯蓣皂苷糖苷酶基因的真核亚克隆
• 3.2.1 含目的基因质粒的酶切鉴定
• 3.2.2 重组质粒的构建
• 3.2.3电转化与筛菌
• 3.3 薯蓣皂苷糖苷酶基因在毕赤酵母菌中的表达
• 3.3.1 产蛋白浓度的测定
• 3.3.2 转基因毕赤酵母产酶蛋白的活性测定
• 3.3.2.1 最佳诱导培养时间的确定
• 3.3.2.2 甲醇诱导浓度
• 3.3.3 转基因毕赤酵母产酶蛋白的分子量测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢