论文摘要
连接蛋白43介导的间隙连接细胞间通讯对维持心脏正常的电生理功能具有重要的作用。心肌梗死并发恶性心律失常与心肌缺血时连接蛋白43去磷酸化及相应的间隙连接功能异常密切相关。研究表明，心肌缺血预处理的保护作用可能与心肌细胞内cAMP浓度升高有关，具体机制未明。同时有研究表明，PKA增加连接蛋白43的表达及其磷酸化程度，增强间隙连接功能。cAMP的细胞生物学效应主要通过PKA介导；因此，研究cAMP对连接蛋白43磷酸化程度的影响及其分子机制，可以为进一步阐明心肌梗死后缺血性心律失常发生机制和干预途径奠定基础。本研究首先通过构建pcDNA3-野生型连接蛋白43质粒（Wt-Cx43-pcDNA3）、pcDNA3-突变型连接蛋白43质粒（S262F-Cx43-pcDNA3，S368A-Cx43-pcDNA3），分别转染HeLa细胞，经G418筛选后得到表达相应连接蛋白43的细胞株（Wt-Cx43-HeLa细胞，S262F-Cx43-HeLa细胞，S368A-Cx43-HeLa细胞）。应用上述细胞株分两部分进行细胞学实验。第一部分是在筛选后细胞株的培养基中加入不同浓度的cAMP类似物8-Br-cAMP（0mol／L，10E-5mol／L，10E-4mol／L，10E-3mol／L），检测细胞生长抑制率，观察8-Br-cAMP对细胞生长的影响。结果表明8-Br-cAMP明显抑制Wt-Cx43-HeLa细胞和S262F-Cx43-HeLa细胞的生长，且呈浓度依赖性；而不同浓度8-Br-cAMP对S368A-Cx43-HeLa细胞的生长影响不明显。第二部分细胞学实验是应用抗连接蛋白43磷酸化特异性位点的抗体(p-connexin43-Ser368和p-connexin43（mSer262-R）进行免疫细胞化学染色，观察8-Br-cAMP对Wt-Cx43-HeLa细胞中连接蛋白43磷酸化程度的影响；并用蛋白激酶PKA的抑制剂H89进一步研究连接蛋白43磷酸化的机制。结果表明8-Br-cAMP呈浓度依赖性地增加连接蛋白43的Ser368位点磷酸化程度，而对Ser262的磷酸化程度无明显影响；H89使连接蛋白43的Ser368位点磷酸化程度减弱，提示与蛋白激酶PKA有关。综上所述，本实验研究表明（1）8-Br-cAMP可以促进Cx43的磷酸化，提高Cx43的磷酸化程度；（2）8-Br-cAMP可以抑制稳定表达Cx43的HeLa细胞的生长；（3）8-Br-cAMP促Cx43磷酸化的主要机制是通过PKA途径增加Cx43C-端S368位点的磷酸化程度，增强细胞GJ功能。
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