血清素对巨核细胞形成前血小板、细胞骨架重构的影响

论文摘要

背景与目的:在出血性疾病中,血小板减少症是一个临床常见问题,其原因有肿瘤放、化疗及造血干细胞移植后骨髓抑制,化疗药物损伤巨核细胞本身,以及遗传性、免疫性疾病如MYH9相关性疾病、特发性血小板减少性紫癜等。目前治疗血小板减少症的主要措施是血小板输注,但反复血小板输注,有输血反应或同种免疫的风险,甚至诱生抗血小板抗体而导致输注无效。如何迅速提高血小板数目及质量又避免抗体产生等不良作用已成为目前临床亟待解决的问题。近年来相继发现了粒细胞集落刺激因子、粒细胞单核细胞集落刺激因子、促红细胞生成素等细胞因子,较好的解决了粒细胞缺乏和贫血等问题,也为血小板减少症的治疗开辟了新的思路。1994年成功分离的促血小板生成素是目前临床用于提升血小板的药物之一,但其临床应用时间较短,且单独使用TPO并不能较快的有效治疗血小板减少症,更因其不可预测的副作用,如:TPO抗体的产生导致的严重出血,限制了TPO在临床应用前景。开发能直接、迅速促进血小板生成、释放的药物已经成为了临床的迫切需要。在巨核细胞形成前血小板和血小板释放的终末调节阶段,细胞骨架重组起着关键作用。细胞骨架由微管、微丝及中间纤维组成,是巨核细胞前血小板生成和血小板释放的动力,微管促进前血小板延伸,微丝促进前血小板分支、扩增,微管抑制剂nocodazole和微丝抑制剂细胞松弛素B或D能阻断前血小板的形成。血清素是一种吲哚胺,除了作为神经递质和血管活性物质,在中枢和周围神经系统及外周器官起着重要的生理功能之外,也是巨核细胞造血的一个选择性生长因子。5-HT能通过作用于巨核细胞表面的5-HT2R促进巨核细胞增殖、分化。另一方面,5-HT参与细胞骨架重组的调节,能引起平滑肌细胞、神经元等细胞的细胞骨架重构,从而影响这些细胞的运动、分化。我们近期的工作初步观察到:加入5-HT作用后,人巨核细胞白血病细胞株Meg-01细胞增殖分化的同时出现肌动蛋白重构。因此,我们设想:血清素可能通过5-HT2R介导细胞骨架重构,促进前血小板形成和血小板释放。本研究希望通过探讨血清素对前血小板形成、巨核细胞骨架重构及巨核细胞表面标志的影响,完善对血小板产生规律以及血清素在血小板生成过程中的作用的认识,有利于新型促血小板生成和释放药物的研发,满足临床迅速提高血小板的迫切需要。方法:本研究主要包括观察血清素促使巨核细胞伪足形成、胞质延伸形成前血小板、细胞骨架重构和探索血清素对巨核细胞表面标志CD41的表达的影响两部分。实验分为4组,分别为:空白对照组;5-HT（200nmol/l）组;5-HT+Kentaserin（5-HT200nmol/l,Kentaserin10μmol/l）组;TPO（50ng/ml）组。首先,分别运用倒置相差显微镜和MTT法再次验证我们的前期工作,即血清素对巨核细胞增殖起促进作用;其次,采用倒置相差显微镜及透射电子显微镜观察血清素对巨核细胞胞质形态改变、形成前血小板及细胞骨架重构的影响;最后通过免疫细胞化学法探讨血清素能否增强巨核细胞表面标志CD41的表达。结果:在倒置相差显微镜下观察,5-HT组和TPO组细胞密度均明显高于对照组和5-HT+Kentaserin组,与MTT法对细胞增殖定量研究的结果同时显示:5-HT组和对照组、5-HT+Kentaserin组比较差别均有统计学意义（P≤0.01）,和TPO组比较无显著性差异（P＞0.05）。倒置相差显微镜的观察同时显示,5-HT组和TPO组巨核细胞伸出伪足、胞质延伸明显多于对照组及5-HT+Kentaserin组,部分前血小板轴延伸长度甚至达胞质本身长度的数倍,5-HT组巨核细胞伪足形成但胞质无延伸比率（22.7±5.98%）及伪足形成且胞质延伸的比率（15.4±5.97%）与对照组（7.3±3.27%及3.6±1.56%）、5-HT+Kentaserin组（8.8±4.5%及5.3±3.31%）比较差异均有显著性（P≤0.05）,与TPO组（22.4±7.30%及7.5±3.59）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。透射电子显微镜的观察可见5-HT组由胞浆延伸形成的轴突较多,其中含较多纵向分布的微管;轴突周边可见张力丝,轴突可见分叉,分叉处致密带形成;胞体及轴突可见散在类似分隔膜系统的空泡状内容物及α颗粒;偶可见释放出的血小板状颗粒,颗粒中含α颗粒或（和）类似分隔膜系统的空泡状内容物。对照组及5-HT加拮抗剂组的巨核细胞形成的轴突较少,分叉不多,类似分隔膜系统的空泡状内容物及α颗粒较少5-HT组或无。TPO组可以见到与5-HT组类似的变化。免疫细胞化学检测巨核细胞表面分化抗原CD41,5-HT组和TPO组CD41阳性细胞率（分别为18.94±3.94%和20.92±7.03%）较对照组（14.28±3.79%）及5-HT+Kentaserin组（14.38±7.56%）虽较高,但比较差异无显著性（P＞0.05）。结论:血清素不仅可促进巨核细胞增殖,而且在巨核细胞分化成熟的终末阶段,血清素可促进巨核细胞骨架重构,显著促进前血小板形成,但对Meg-01细胞表面标志CD41的表达无明显影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词汇表
• 目录
• 第1章 前言
• 1.1 寻找新疗法治疗血小板减少症迫在眉睫
• 1.2 巨核细胞分化、血小板生成的一般过程
• 1.3 细胞骨架是巨核细胞形成前血小板和血小板释放的关键
• 1.4 细胞骨架相关性血小板疾病
• 1.5 影响巨核系造血的细胞因子
• 1.6 血清素是巨核系的选择性生长因子
• 1.7 血清素对细胞骨架的作用
• 1.8 血清素可能通过作用于细胞骨架影响巨核细胞形成前血小板及血小板释放
• 1.9 拟解决的问题
• 第2章 实验设计
• 第3章 材料与方法
• 3.1 试剂及仪器
• 3.2 实验方法
• 第4章 结果及附图
• 4.1 结果
• 4.2 附图
• 讨论
• 1 血清素是巨核系的选择性生长因子
• 2 血清素对巨核细胞骨架的影响
• 结论与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢