论文摘要
第一部分反式桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响目的:研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde,TCA）对急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞增殖和凋亡的影响。方法:用不同浓度的TCA和/或阿糖胞苷（β-D-Arabinofuranosyl cytosine,AraC）处理AML细胞株HL60或AML初治患者及健康人骨髓单个核细胞（ bone marrow mononuclear cell,BMMNC）。CCK-8法测定HL60细胞增殖活性,流式细胞术检测HL60细胞周期变化, Annexin V/PI双标法检测HL60细胞和BMMNC凋亡,CD45/CD34/Annexin V三标法检测BMMNC CD34+细胞凋亡。Western blot检测TCA处理后HL60细胞c-myc基因表达。激光共聚焦术检测TCA处理后HL60细胞NF-κB活性。甲基纤维素法检测TCA处理后BMMNC克隆形成。结果:TCA呈时间和剂量依赖性影响HL60细胞增殖。低浓度（10μM,20μM）TCA作用24 h后,促进HL60细胞增殖,和阴性对照组相比,有显著差异（P<0.05）。而较高浓度TCA对HL60细胞的增殖表现出抑制效应,并随浓度增加抑制作用明显增强。各浓度TCA作用48 h和72 h均表现出对HL60细胞增殖的抑制效应。TCA作用HL60细胞24 h,48 h和72 h的IC50分别为78.40μM,58.13μM和50.31μM。高浓度TCA（≥80μM）可诱导>10%细胞发生凋亡,增加TCA的作用浓度使HL60细胞凋亡率进一步增加。TCA浓度≤60μM时作用24 h后,HL60细胞凋亡率<5%。在中浓度（40μM,60μM）TCA作用下,随作用时间延长, HL60细胞凋亡率也逐渐增加。低浓度（10μM,20μM）TCA始终不能显著增加凋亡率。中浓度TCA作用24 h后,HL60细胞明显阻滞于G2 /M。低浓度TCA作用24 h对细胞周期无明显影响,作用72 h后,细胞周期阻滞于G0/G1期。HL60细胞高表达c-Myc蛋白,TCA呈时间和剂量依赖性显著抑制c-Myc蛋白的表达。100μM TCA作用4 h后,HL60细胞NF-κB失活。TCA呈剂量依赖性诱导AML BMMNC和CD34+细胞凋亡,TCA对正常BMMNC和CD34+细胞的细胞毒作用很小,差异有显著性（P<0.05）。TCA非谱系特异性抑制AML原代细胞克隆形成。TCA协同AraC对HL60细胞、AML原代细胞及AML CD34+细胞的细胞毒性作用。结论: TCA通过使NF-κB失活,下调原癌基因c-myc的表达,使HL60细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡,发挥抗白血病效应。TCA对AML BMMNC和CD34+细胞也产生明显的凋亡诱导效应,并能协同AraC发挥抗白血病效应,对正常BMMNC的细胞毒作用很小。第二部分反式桂皮醛对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响目的:研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde,TCA）对慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）细胞增殖和凋亡的影响。方法:用不同浓度的TCA处理CML细胞株K562和初治CML患者及健康人骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cell,BMMNC）。CCK-8法测定K562细胞增殖活性,流式细胞术检测K562细胞周期变化、K562细胞和BMMNC凋亡及K562细胞膜电位和Fas抗原表达。Western blot检测K562细胞c-myc基因表达和Crkl蛋白磷酸化水平。Real time PCR检测K562细胞Bcr-Abl mRNA表达。甲基纤维素法检测CML BMMNC克隆形成。结果:TCA对K562的增殖作用的影响呈时间和剂量依赖性。低浓度（30μM）TCA作用24 h和48 h促进K562细胞增殖,和阴性对照组相比,有显著差异（P<0.01）;作用72 h,抑制K562细胞增殖（P<0.01）。较高浓度TCA对K562细胞的增殖始终表现出抑制效应,并随浓度增加抑制作用明显增强。TCA处理K562细胞24 h的IC50是157.42μM。低浓度（30μM） TCA始终不能诱导K562细胞凋亡,中浓度（60μM）TCA作用24 h,仅极少部分细胞产生凋亡,与对照组细胞相比,差异无统计学意义（P>0.05）。高浓度TCA（≥90μM）作用24 h后可诱导>10%细胞发生凋亡,增加TCA浓度和作用时间可诱导更多细胞凋亡。60μM TCA作用24 h使K562细胞明显阻滞于G2 / M期,而30μM TCA则轻微增加G2 /M期细胞的比例（P>0.05）。K562细胞高表达c-Myc蛋白和磷酸化Crkl,TCA呈时间和剂量依赖性明显抑制c-Myc蛋白的表达和Crkl磷酸化水平。TCA呈时间和剂量依赖性下调线粒体跨膜电位和上调K562细胞的Fas表达。TCA呈剂量依赖性抑制K562细胞的Bcr-Abl转录水平。TCA呈剂量依赖性诱导CML BMMNC凋亡,对正常BMMNC的细胞毒作用很小。TCA非谱系特异性抑制CML BMMNC克隆形成。结论:低浓度TCA（≤30μM）早期可能促进K562细胞增殖,而后期可诱导细胞周期阻滞,从而抑制K562细胞生长。中浓度TCA（60μM）早期阻滞细胞周期于G2 /M期,而随作用时间延长,诱导细胞出现凋亡。高浓度TCA（≥90μM）则通过诱导细胞凋亡,从而抑制K562细胞的生长,凋亡率呈时间和剂量依赖性。两条主要的凋亡通路,即线粒体介导和Fas介导的凋亡通路,都参与了TCA诱导的凋亡。TCA可能通过抑制Bcr-Abl转录,从而减少Bcr-Abl蛋白产物,削弱酪氨酸激酶效应,下调c-myc癌基因的蛋白表达,导致CML细胞凋亡、抑制CML细胞增殖。以上提示TCA具有明显的抗慢性髓细胞白血病效应,对正常骨髓单个核细胞的细胞毒作用很小,是一个很有应用前景的药。第三部分反式桂皮醛诱导髓细胞白血病细胞分化目的:本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde,TCA）对髓细胞白血病细胞分化的影响及机制。方法:用TCA和/或反式维甲酸（all-trans-Retinoic acid,ATRA）处理髓细胞白血病细胞株HL60细胞及K562细胞。相差显微镜和Wright’s-Gimsa染色观察细胞形态变化。流式细胞术检测细胞分化抗原表达、细胞周期和凋亡。Western blot检测HL60细胞c-myc基因和p27基因表达、K562细胞c-myc基因表达和Crkl蛋白磷酸化水平。激光共聚焦术检测HL60细胞p16基因和Cdc6基因表达变化。结果: TCA（≤60μM）诱导HL60细胞向成熟粒细胞分化,细胞表面分化抗原CD11b表达增加。TCA（≤60μM）诱导K562细胞向单核-巨噬细胞分化,细胞表面分化抗原CD14和CD11b表达均增加。低浓度（20μM）TCA作用72 h使HL60细胞阻滞于G0/G1期,不诱导明显细胞凋亡;中浓度（60μM）TCA作用24 h,HL60细胞G2/M期比例明显增加,G0/ G1期细胞比例明显下降,持续作用48 h时,HL60出现G2/M细胞比例降低,出现明显凋亡。中浓度（60μM）TCA作用于K562细胞24 h后,G2/M期细胞比例明显增加,持续作用48 h后,G2/M期细胞比例进一步增加,作用72 h时,K562细胞G2/M期比例下降,出现明显凋亡。TCA诱导HL60细胞分化伴原癌基因c-myc表达下降,细胞周期相关蛋白p27表达增强。TCA诱导K562细胞分化伴c-myc基因表达下调,Crkl蛋白磷酸化水平下降。TCA诱导HL60细胞分化还伴p16蛋白表达增加,向核内移位,而Cdc6蛋白表达下降,向核外迁移。TCA可协同增强ARTA对HL60细胞的诱导分化效应。结论: TCA（≤60μM）可诱导髓细胞白血病细胞分化,但不同种类的细胞对TCA的反应有差异性,而且同种白血病细胞对不同浓度的TCA的反应不同。TCA诱导HL60白血病细胞分化与c-myc蛋白水平下降和p27蛋白水平上调有关,p16基因和Cdc6基因参与TCA诱导的HL60细胞分化过程。TCA可增强ATRA对HL60细胞的诱导分化效应。TCA诱导K562细胞的分化与c-myc和Crkl蛋白磷酸化水平下降有关。第四部分反式桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞粘附和迁移的影响目的:本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde,TCA）对急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞粘附和迁移的影响。方法:TCA处理AML细胞株HL60细胞,流式检测细胞表面CXCR4的表达。Transwell法检测不同浓度TCA对重组基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α,SDF-1α）诱导的HL60迁移和浸润的影响。羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE）标记HL60细胞,共聚焦显微镜和流式细胞术检测HL60细胞染色情况。CFSE标记的HL60细胞与AML骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell, BMSC）共培养,用共聚焦检测不同浓度TCA处理后HL60细胞与AML BMSC的粘附情况。ELISA法检测TCA对AML BMSC分泌SDF-1α的影响。相差显微镜观察TCA处理后AML BMSC细胞形态变化,流式细胞术检测AML BMSC细胞凋亡。结果:TCA作用后,HL细胞CXCR4表达的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）呈时间和剂量依赖性明显下降（P值均<0.05）。TCA呈剂量依赖性抑制HL60趋向重组人SDF-1α的迁移和浸润。CFSE标记后培养过夜的HL60细胞发出很强的绿色强荧光,在细胞核和细胞质内均有分布,而未标记的HL60细胞和BMSC未见荧光。TCA作用6 h后呈剂量依赖性抑制HL60细胞与AML BMSC间的粘附。TCA呈剂量依赖性抑制AML BMSC分泌SDF-1α。TCA作用24 h,AML BMSC细胞间隙增大。TCA呈现时间和剂量依赖性诱导AML BMSC凋亡。结论:TCA除可直接抑制白血病细胞的增殖、诱导白血病细胞凋亡和分化外,还可能通过下调白血病细胞CXCR4表达、抑制骨髓基质细胞SDF-1分泌和诱导骨髓基质细胞凋亡、抑制白血病细胞对骨髓基质细胞的趋化,使白血病细胞一方面失去基质层的支持,另一方面易于发生凋亡,因此有可能削弱骨髓基质细胞对白血病细胞潜在的保护作用,有利于清除髓内白血病细胞。第五部分反式桂皮醛调节髓细胞白血病细胞mel18基因表达目的:本研究旨在检测mel18基因在急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）的表达,研究mel18基因对AML细胞的增殖、凋亡和周期的影响,探讨反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde,TCA）对AML细胞mel18基因的调控。方法:运用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）检测白血病细胞株mel18 mRNA表达,生物素-生物素-过氧化物酶（avidin-biotin-peroxidase complex,ABC）法免疫组织化学（immunohistochemistry stain,IHC）染色分析髓细胞白血病细胞株、初治AML患者骨髓单个核细胞和健康人外周血及骨髓单个核细胞的Mel18蛋白表达。运用十四酰佛波乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetaet,PMA）诱导HL60细胞分化,流式细胞术、免疫组化法和激光共聚焦术检测诱导分化细胞的Mel18蛋白表达变化。通过基因重组和分子克隆技术构建pLenti6/V5-mel18真核表达载体并鉴定,应用脂质体（Lipofectamine2000?）转染,将pLenti6/V5-mel18和pLenti6/V5-LacZ（阴性对照）导入HL60和U937细胞。RT- PCR和流式细胞术检测pLenti6/V5-mel18质粒转染细胞中mel8基因的表达。用CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。TCA诱导K562细胞和HL60细胞分化,流式细胞术和激光共聚焦术检测Mel18蛋白表达。结果:mel18 mRNA在K562细胞强表达,HL60细胞弱表达,U937细胞无表达。Mel18蛋白主要表达在细胞质中,在K562细胞和正常外周血中高表达,HL60和正常骨髓单个核细胞中低表达,而U937细胞不表达Mel18蛋白。Mel18蛋白在AML骨髓中缺失率为58.8 %,正常对照骨髓单个核细胞中未检测到Mel18蛋白缺失。HL60细胞被PMA诱导分化后Mel18蛋白表达增加,亚细胞定位不变。重组质粒pLenti6/V5-mel18经过PCR检测和公司测序证实构建成功。pLenti6/V5-mel18质粒转染24 h后, U937细胞和HL60细胞的mel18基因表达增加,转染pLenti6/V5-mel18的U937细胞和HL60细胞增殖受抑,细胞出现凋亡,G0/G1期细胞比例增加。TCA诱导HL60细胞和K562细胞分化伴Mel18蛋白表达增加,Mel18亚细胞定位不发生改变。结论: mel18基因在AML中表达降低,mel18基因的表达与分化相关。mel18在AML中可能发挥抑癌基因的作用,增强mel18基因的表达可抑制AML细胞株增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞。TCA诱导白血病细胞分化可增加mel18基因的表达。
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