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单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性

2020-11-22阅读(578)

单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性

论文摘要

单核细胞增多性李斯特菌（简称单增李斯特菌，Lm）为重要的食源性病原菌，能引起人的败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎，虽然发生率不高，但死亡率可达30％。不同来源Lm的致病性差异较大，有些菌株致病性很强，而另一些菌株毒力较弱甚至无致病性。将Lm减毒后作为携带外源基因的基因工程疫苗载体是近年来国外学者研究的热点之一。国内在Lm分离株的生物学特性、遗传多样性、基因结构与功能及其疫苗载体的研究方面鲜见报道。本研究以小鼠和鸡胚LD50试验及体外培养鼠成纤维细胞的空斑形成试验比较了20株Lm食品及环境分离株的毒力。结果表明：大多数Lm分离株毒力与参考菌株10403S相当，对小鼠的LD50在103.86-106.74之间，对鸡胚的LD50在101.23-103.35之间，为强毒株；分离株H4对小鼠和鸡胚的LD50分别为108.14和106.73，为弱毒株。空斑形成试验与LD50结果基本一致，大多数单增李斯特菌分离株感染孔均有清晰的空斑形成。相对于参考菌株而言，它们的大小在83.7％-108.3％之间，而弱毒株H4感染孔无可见空斑。选取Lm的毒力基因actA，InlA和InlB高变区域外测保守区设计引物进行PCR扩增，T-A克隆至pMD18-T载体后进行测序，对20个Lm的食品及其环境分离株进行多位点序列分型。基于actA和InlA序列的分型结果基本一致，可将21个菌株分成6个亚型，与基于InlB的序列分型略有差异。综合上述3个毒力基因的分型结果可将所有菌株分成8个序列亚型，分别为S1-S8，其中菌株0194、10403S和H4各自成一亚型。用SmaⅠ对上述菌株基因组DNA进行酶切，以脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法将21个菌株划分为6个亚型，分辨力与序列分型结果相当，弱毒株H4自成P6亚型。此外，分离自同一加工厂的海产品分离株1056，1057及其环境分离株6属于同一序列或PFGE亚型，表明该加工企业成品中的Lm来自其加工环境。消毒奶分离株320与其环境分离株690共为同一序列或PFGE亚型，表明成品奶中污染的Lm来自加工环境，而非奶牛场。为探讨Lm H4株弱毒的分子基础，对其主要毒力相关基因（iap，prfA，plcA，hly，mpl，actA，plcB，InlA和InlB）进行了测序和系统分析。体外试验表明：分离株H4与参考菌株10403S相比，具有相似的溶血活性和细胞侵袭力，但具有更强的细胞黏附力、更高的细胞内增殖水平和更强的溶脂活性。而H4株对小鼠及鸡胚的LD50比菌株10403S毒力分别低2.7和4.8个对数。菌株H4与10403S及EGD的prfA、plcA和mpl具有很高同源性（＞98％）；与10403S菌株的hly基因核苷酸同源性为96.9％，氨基酸同源性为98.7％，体外溶血活性相似；与10403S菌株的plcB基因核苷酸同源性为95.4％，包含ORF第1位碱基及其上游序列-26位的突变（A-G，C-T），有可能使ORF从-27位开始形成，这一变化可能导致H4的强溶脂活性。H4株在肌动蛋白ActA的脯氨酸富集区有35个氨基酸缺失。本研究结果表明：单增李斯特菌H4株对小鼠和鸡胚的低毒力可能与actA中脯氨酸富集区的部分缺失而引起的细胞间迁移能力下降或丧失有关。为探明单增李斯特菌弱毒株H4强溶脂活性的分子基础，根据前期对plcB ORF及其上游序列分析结果，首先设计引物扩增plcB同源区（包含上游序列），定向克隆至pUC18，构建pUC18-plcB。设计3对点突变引物，以pUC18-plcB为模板进行PCR扩增，分别将plcB上游第26位（-26位）及ORF第1位双突变或-26位单突变为参考菌株10403S的相应碱基，测序确认后命名为pUC18-△plcB1、pUC18-△plcB2和pUC18-△plcB3。继而亚克隆至pKSV7，构建重组穿梭质粒pKSV7-△plcB1、pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3，并将其电转入H4株的感受态细胞中，利用同源重组技术实现目的碱基的置换，构建H4的突变株H4-△plcB1、H4-△plcB2和H4-△plcB3。目的片段的PCR扩增及序列分析表明各突变株构建成功。在含5％的卵黄琼脂平板中，各突变株均无溶脂活性，表明H4菌株强溶脂活性由plcB上游第26位碱基的突变（C-T）、致其ORF从-27位开始形成有关，比参考菌株10403S多9个氨基酸。这一突变对H4株plcB基因表达的增强作用机制还有待进一步探索。另外，小鼠LD50试验表明突变株H4-△plcB1毒力比其亲本菌株H4提高1个Log，初步表明H4菌株中两个膜裂解相关基因hly与plcB的高效表达及协同作用可能增强了细菌对宿主细胞的毒性，并暴露于宿主的免疫系统而被清除，从而降低了对宿主的致病性。单增李斯特菌为侵袭性胞内菌，可在专职和非专职吞噬细胞内存活并繁殖，是目前疫苗载体研究的热点之一。以绿色荧光蛋白基因gfp为模式外源基因，以单增李斯特菌毒力基因hly为靶基因，通过基因切割-重叠延伸PCR法及同源重组技术构建表达GFP的重组单增李斯特菌。首先构建了pKSV7质粒衍生体，此质粒含有hly的启动子和信号肽序列，gfp片段及hly的同源区，通过电穿孔法把该质粒转入野生型Lm 10403S株，经两次等位基因交换将gfp片段整合入Lm染色体基因组中。目的片段的PCR、序列测定及该重组菌在显微镜下发出的绿色荧光表明该重组子的构建成功。溶血试验表明hly基因中gfp的插入后溶血活性消失，对Hela细胞的黏附和侵袭力降低。此外，小鼠及鸡胚的LD50试验表明该重组菌比其亲本菌株毒力下降了2个Log。以新城疫病毒（NDV）编码融合蛋白的截短片段Fa为外源基因，通过基因切割-重叠延伸PCR法将其插入到单增李斯特菌毒力基因plcB信号肽序列下游，定向克隆至穿梭质粒pKSV7，并电转入单增李斯特菌10403S，通过同源重组技术构建携带NDV Fa片段的重组单增李斯特菌。PCR扩增结果表明重组菌Lm-△plcB-Fa构建成功。RT-PCR结果表明整合的外源基因能在重组菌中转录，SDS-PAGE及Western blot分析表明融合蛋白Fa能在重组菌中表达，与NDV阳性血清具有免疫反应性。毒力试验表明重组菌对小鼠与鸡胚的毒力降低，LD50比其亲本菌株下降1.7-2.3个Log。重组菌Lm-△plcB-Fa对细胞的黏附和侵袭力均低于亲本株10403S（P＜0.05）。然而，重组菌口服或腹腔免疫SPF鸡后，均未能有效诱导针对NDV和融合蛋白Fa的特异性抗体，也未能保护NDV强毒的攻击。其可能原因是重组单增李斯特菌在鸡体内持续存在时间短、增殖率低，进而导致外源基因的低水平表达。本试验结果为深入探索单增李斯特菌的致病机理、对食品污染的控制和基因工程疫苗载体的研究奠定了良好基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力因子
  • 1 黏附侵袭相关毒力因子
  • 1.1 内化素（Internalins）
  • 1.2 酰胺酶（Ami）
  • 1.3 细胞壁水解酶（p60）
  • 1.4 纤连蛋白结合蛋白A（FbpA）
  • 1.5 李斯特菌溶血素（LLO）
  • 1.6 肌动蛋白聚集因子（ActA）
  • 1.7 白溶素（Auto）
  • 2 细胞内感染相关毒力因子
  • 2.1 李斯特菌溶血素（LLO）,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶（PI-PLC）和卵磷脂酶（PC-PLC）
  • 2.2 肌动蛋白聚集因子（ActA）
  • 2.3 己糖磷酸盐转运蛋白（Hpt）
  • 3 毒力调控因子
  • 3.1 转录活化因子（PrfA）
  • 3.2 应答调控因子（VirR）
  • 4 其它毒力因子
  • 4.1 分拣酶（Sortase）
  • 4.2 胆酸盐水解酶（BSH）
  • 5 总结
  • 第二章 单核细胞增多性李斯特菌的分型技术
  • 1 单增李斯特菌的传统表型分析法
  • 1.1 血清分型（serotyping）
  • 1.2 噬菌体分型（phagetyping）
  • 1.3 多区带酶电泳分型（multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）
  • 1.4 酯酶分型（esterase typing）
  • 2 单增李斯特菌的分子分型法
  • 2.1 脉冲场凝胶电泳分型（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）
  • 2.2 核糖体分型（ribotyping）
  • 2.3 基于PCR的分型技术（PCR-based subtyping techniques）
  • 2.3.1 随机扩增DNA多态性分析分型（RAPD）及随机引物PCR扩增分型（AP-PCR）
  • 2.3.2 扩增片段长度多态性分析分型（AFLP）
  • 2.3.3 PCR-限制性片段长度多态性分析分型（PCR-RFLP）
  • 2.3.4 重复片段PCR分型（REP-PCR）
  • 2.3.5 单链构象多态性分析分型（SSCP）
  • 2.3.6 扩增基因间位点多态性分析分型（AILP）
  • 2.4 基于DNA序列的分型技术-多位点序列分型（MLST）
  • 3 总结
  • 第三章 单核细胞增多性李斯特菌作为疫苗载体的研究进展
  • 1 单核细胞增多性李斯特菌作为疫苗载体的基础
  • 2 单增李斯特菌的减毒方法
  • 2.1 基于毒力基因的缺失或插入突变
  • 2.1.1 毒力基因缺失突变
  • 2.1.2 毒力基因插入突变
  • 2.2 营养缺陷型突变
  • 3 表达外源基因重组单增李斯特菌的构建
  • 4 单增李斯特菌作为疫苗载体的应用
  • 4.1 单增李斯特菌作为携带病毒性抗原的载体
  • 4.1.1 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）
  • 4.1.2 免疫缺陷病毒（HIV或FIV）
  • 4.1.3 人的乳头瘤病毒（HPV）
  • 4.2 单增李斯特菌作为携带寄生虫性抗原的载体
  • 4.3 作为DNA疫苗的载体
  • 4.4 在其他肿瘤方面的应用
  • 4.5 用于其他新型疫苗的研究
  • 5 单增李斯特菌作为疫苗载体的潜在危险性
  • 6 总结
  • 第二部分 实验研究
  • 第一章 单核细胞增多性李斯特菌食品及环境分离株的毒力比较
  • 1 材料和方法
  • 1.1 菌株及培养基
  • 1.2 试剂
  • 1.3 实验动物及细胞
  • 50试验'>1.4 小鼠及鸡胚的LD50试验
  • 1.5 L929细胞的空斑形成试验
  • 2 结果
  • 2.1 小鼠及鸡胚毒力试验表明大多数单增李斯特菌分离株的毒力与参考菌株10403S相当
  • 2.2 L929细胞空斑形成试验表明大多数单增李斯特菌分离株为强毒株
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第二章 单核细胞增多性李斯特菌食品及环境分离株分型技术研究
  • 1 材料和方法
  • 1.1 菌株,质粒及培养基
  • 1.2 工具酶和试剂
  • 1.3 actA,InlA和InlB短片段的PCR扩增、克隆和序列分析
  • 1.4 单增李斯特菌分离株的脉冲场凝胶电泳
  • 2 结果
  • 2.1 单增李斯特菌分离株actA、InlA和InlB的PCR扩增及重组质粒pMD18-T-actA（InlA和InlB）构建
  • 2.2 基于actA的单增李斯特菌序列分型
  • 2.3 基于InlA的单增李斯特菌序列分型
  • 2.4 基于InlB的单增李斯特菌序列分型
  • 2.5 单增李斯特菌食品及环境分离株的多位点序列分型综合
  • 2.6 单增李斯特菌食品及环境分离株的PFGE分型
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第三章 单核细胞增多性李斯特菌奶源分离株H4毒力相关表型与基因分析
  • 1 材料和方法
  • 1.1 菌株,质粒,培养基,试剂和引物
  • 1.2 实验动物及细胞系
  • 50试验'>1.3 鸡胚及小鼠的LD50试验
  • 1.4 溶血价的测定及溶血活性的观察
  • 1.5 体外生长试验
  • 1.6 L929细胞中的空斑形成试验
  • 1.7 对细胞的黏附、侵袭力和细胞内增殖试验
  • 1.8 溶脂活性试验
  • 1.9 主要毒力基因的T-A克隆及序列分析
  • 2 结果
  • 2.1 小鼠和鸡胚毒力试验表明H4菌株为弱毒株
  • 2.2 毒力相关的表型分析
  • 2.3 单增李斯特菌主要毒力基因的序列分析
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第四章 单核细胞增多性李斯特菌奶源分离株H4强溶脂活性的分子基础
  • 1 材料和方法
  • 1.1 菌株,质粒,培养基和引物
  • 1.2 工具酶和试剂（盒）
  • 1.3 细菌DNA抽提
  • 1.4 同源重组区靶基因片段plcB的PCR扩增及重组质粒pUC18-plcB的构建
  • 1.5 点突变
  • 1.6 重组质粒pKSV7-△plcB1,pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3的构建
  • 1.7 突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的构建与鉴定
  • 1.8 突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的溶脂活性研究
  • 50试验'>1.9 突变株H4-△plcB1的小鼠LD50试验
  • 2 结果
  • 2.1 plcB靶目的片段的PCR扩增及重组质粒pUC18-plcB的鉴定
  • 2.2 重组质粒pKSV7-△plcB1,pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3的鉴定
  • 2.3 突变株H4-△plcB1,H4-△plcB2和H4-△plcB3的鉴定
  • 2.4 plcB的-26位和ORF第1位突变为参考菌株10403S的相应碱基后消除了H4菌株的强溶脂活性,且毒力增强
  • 2.5 plcB的-26位突变为参考菌株10403S的相应碱基后也消除了H4菌株的强溶脂活性
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第五章 表达绿色荧光蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌的构建及其生物学特性
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 质粒、菌株
  • 1.1.2 工具酶
  • 1.1.3 主要试剂及试剂盒
  • 1.1.4 实验动物和细胞
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 细菌DNA抽提
  • 1.2.2 引物的设计及合成
  • 1.2.3 同源重组区靶基因片段hly的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly的构建
  • 1.2.4 重组穿梭质粒pKSV7-△hly-gfp的构建
  • 1.2.5 重组菌Lm-△hly-gfp的构建
  • 1.2.6 RT-PCR扩增重组菌Lm-△hly-gfp的gfp片段
  • 1.2.7 重组菌Lm-△hly-gfp的荧光观察
  • 1.2.8 HeLa细胞侵袭力试验
  • 1.2.9 鸡胚和小鼠毒力试验
  • 1.2.10 单增李斯特菌Lm-△hly-gfp株溶血活性变化
  • 1.2.11 单增李斯特菌Lm-△hly-gfp株的体外生长试验
  • 2 结果
  • 2.1 Lm溶血素基因hly靶目的片段的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly的构建
  • 2.2 绿色荧光蛋白gfp基因的PCR扩增及重组质粒pUC18-△hly-gfp的构建
  • 2.3 重组质粒pKSV7-△hly-gfp的构建
  • 2.4 重组菌Lm-△hly-gfp的构建与鉴定
  • 2.4.1 阳性转化子的鉴定
  • 2.4.2 目的基因片段gfp实现同源重组,整合到Lm10403S基因组中
  • 2.5 RT-PCR表明gfp能在重组菌Lm-△hly-gfp中转录
  • 2.6 重组菌Lm-△hly-gfp能表达绿色荧光蛋白GFP
  • 2.7 外源基因的整合降低了重组菌Lm-△hly-gfp对Hela细胞的侵袭力及对鸡胚和小鼠的毒力
  • 2.8 重组菌Lm-△hly-gfp丧失了溶血活性
  • 2.9 重组菌Lm△-hly-gfp与野生型菌株10403S具有相似的体外生长特性
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第六章 表达新城疫病毒融合蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建及其免疫原性
  • 1 材料和方法
  • 1.1 菌株,质粒及培养基
  • 1.2 工具酶及主要试剂（盒）
  • 1.3 实验动物及细胞
  • 1.4 细菌DNA抽提
  • 1.5 基因切割-重叠延伸PCR扩增plcB同源区及重组质粒pUC18-△plcB的构建
  • 1.6 重组穿梭质粒pKSV7-△plcB-Fa的构建
  • 1.7 重组菌Lm-△plcB-Fa的构建
  • 1.8 RT-PCR扩增重组菌Lm-△plcB-Fa的Fa片段
  • 1.9 SDS-PAGE及Westernblot检测重组菌Lm-△plcB-Fa中Fa的表达
  • 1.10 重组菌Lm-△plcB-Fa的体内外稳定性
  • 1.11 重组菌的体外生长试验
  • 1.12 重组菌Lm-△plcB-Fa的HeLa细胞侵袭力试验
  • 1.13 ICR小鼠及鸡胚毒力试验
  • 1.14 重组菌的SPF鸡免疫保护试验
  • 1.14.1 试验分组及免疫
  • 1.14.2 细菌分离
  • 1.14.3 采血及间接ELISA法检测抗体效价
  • 1.14.4 NDV攻毒
  • 2 结果
  • 2.1 重组质粒pUC18-△plcB的鉴定
  • 2.2 重组穿梭质粒pKSV7-△plcB-Fa的构建
  • 2.3 重组单增李斯特菌Lm-△plcB-Fa的鉴定
  • 2.4 RT-PCR表明Fa片段能在重组菌中转录
  • 2.5 重组菌Lm-△plcB-Fa能表达Fa
  • 2.6 重组菌Lm-△plcB-Fa在体内外均稳定,且与野生型菌株具有相似的体外生长特性
  • 2.7 重组菌Lm-△plcB-Fa对HeLa细胞的侵袭率下降,对鸡胚和小鼠的毒力降低
  • 2.8 携带外源基因的重组菌免疫雏鸡的免疫保护性试验
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 结论与展望
  • 附录 常用缓冲液及培养基配方
  • 致谢
  • 攻读博士期间的发表的学术论文

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