小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞诱导分化的研究

论文摘要

利用胚胎干细胞（ESCs）向生殖细胞的分化在体外建立研究生殖细胞发育分化的模型,具有可重复性和可控制性,在研究生殖细胞的发生、增殖、分化及调控和治疗人类不孕不育症等方面具有重要意义。近几年,已有多篇关于ESCs在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞（PGCs）并进一步生成成熟配子的报道。但ESCs向生殖细胞的诱导效率仍然很低。本研究筛选维甲酸（RA）浓度,睾丸提取液,睾丸细胞条件培养液,雌激素（E2）和促卵泡激素（FSH）等诱导小鼠胚胎干细胞（ mESCs）向生殖细胞分化的效果,进一步利用转染pStra8-EGFP的mESCs,通过形成类胚体（EB）的方法,采用添加RA（0.2μM ）、小鼠睾丸细胞条件培养液（40%）、E2（1μg/mL）和FSH（0.1 IU/mL）,结合与小鼠睾丸支持细胞（Sertoli cells）共培养技术定向诱导小鼠ESCs向雄性生殖细胞分化,以建立定向分化为雄性生殖细胞的稳定体系,为研究哺乳动物雄性生殖细胞的发生及机理建立可靠的模型。1.采用悬滴培养mESCs的方法形成EB,比较了不同细胞数形成EB的质量,研究表明1200个细胞/滴形成的EB质量比800和400个细胞/滴形成的EB质量高。将第3d形成的EB,接在铺有0.1%明胶的24孔板中,10个EBs/孔,分别采用20μM、2μM、0.2μM三个RA浓度梯度和对照进行诱导。第4 d和第7 d ,RT-PCR和免疫荧光染色的结果证明,0.2μM的RA诱导mESCs分化为原始生殖细胞（PGCs）的效率明显高于其它组。第4 d和第7 d,VASA的阳性率分别为36%和52%,均为各组最高;SCP3的阳性率分别为32%和45%,也为各组最高。另外,初步的研究结果也表明睾丸细胞条件培养液,雌激素（E2）和促卵泡激素（FSH）等诱导mESCs向生殖细胞分化具有一定效果,睾丸提取液诱导效果不明显。2.将pStra8-EGFP质粒通过电转染的方法转入mESCs作为向雄性生殖细胞分化的标记,通过浓度为200μg/mL的G418筛选2 W,获得稳定转染的细胞株（ES-Stra8）,其能稳定增殖,已传至22代。RT-PCR和免疫荧光染色证明ES-Stra8表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因,具有自发向3胚层细胞分化的潜能。ES-Stra8制作成EB,接到经丝裂霉素C处理的支持细胞上,添加0.2μM RA、40%睾丸细胞条件培养液、1μg/mL E2和0.1 IU/mL FSH,诱导ES-Stra8向雄性生殖细胞分化。流式分选结果表明在第7 d后有1.8% GFP阳性细胞,RT-PCR和免疫荧光检测,其在RNA和蛋白两个水平上表达OCT4、VASA、SCP3、FE-J1等生殖细胞特异性标记。细胞周期检测证实处于G1期细胞明显增多,达到G1%=91.118,接近精原细胞（G1%=91.334）,苯胺兰染色结果也表明细胞核发生浓缩。在第31 d,发现有类似于精子样的细胞。3. mESCs经上述诱导方法诱导7 d,用DAPI标记12 h后移植到生精缺陷模型小鼠睾丸内,4 W后采样。荧光检测、细胞培养和组织学检测证实移植细胞能够在睾丸内存活,并且移植鼠受损的曲细精管得到一定程度的修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 干细胞分化为生殖细胞的研究进展
• 1.1 干细胞
• 1.1.1 胚胎干细胞
• 1.1.2 成体干细胞
• 1.2 生殖细胞
• 1.2.1 原始生殖细胞的起源和发生
• 1.2.2 生殖细胞发育、分化的标记基因
• 1.3 ESCs 体外向生殖细胞诱导分化方法
• 1.3.1 单层和EB 方式诱导
• 1.3.2 ESCs 体外向生殖细胞诱导方法
• 1.4 干细胞向生殖细胞的诱导分化研究进展
• 1.4.1 胚胎干细胞向生殖细胞的分化
• 1.4.2 成体干细胞向生殖细胞的分化的研究
• 1.4.3 干细胞诱导生殖细胞的体内移植研究
• 1.5 存在的问题及展望
• 第二章 小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞诱导条件的筛选与优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备及耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 主要溶液配制
• 2.2.2 小鼠胚胎干细胞的培养
• 2.2.3 有血清和无血清ESCs 培养体系的比较
• 2.2.4 类胚体制作方法的比较
• 2.2.5 不同浓度RA 诱导效率的比较
• 2+FSH）诱导ESCs 向生殖细胞分化'>2.2.6 睾丸提取液、条件培养液、激素（E₂+FSH）诱导ESCs 向生殖细胞分化
• 2.3 结果
• 2.3.1 MEF 细胞的生长特点
• 2.3.2 mESCs 的培养
• 2.3.3 无血清和有血清培养体系
• 2.3.4 EB 制作方法的比较
• 2.3.5 RA 浓度的比较结果
• 2+FSH）诱导mESCs 向生殖细胞分化'>2.3.6 睾丸提取液、条件培养液、激素（E₂+FSH）诱导mESCs 向生殖细胞分化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 Stra8-EGFP 转染ESCs 向雄性生殖细胞的诱导分化
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 主要溶液配制
• 3.2.2 小鼠ESCs 的培养
• 3.2.3 pStra8-EGFP 质粒转化与提取
• 3.2.5 pStra8-EGFP 电转染mESCs
• 3.2.6 筛选与培养
• 3.2.7 EB 的制作
• 3.2.8 ES-Stra8 生物学特性的检测
• 3.2.9 诱导ESC-Stra8 向雄性生殖细胞分化
• 3.3 结果
• 3.3.1 ES-Stra8 的形态学特征
• 3.3.2 ES-Stra8 AP 染色结果
• 3.3.3 ES-Stra8 的多能性和GFP 基因的RT-PCR 检测
• 3.3.4 ES-Stra8 向三胚层细胞分化免疫组织化学染色
• 3.3.5 分离培养的支持细胞
• 3.3.6 EB 与支持细胞共培养的形态学观察
• 3.3.7 ES-Stra8 与支持细胞共培养的RT-PCR 检测
• 3.3.8 ES-Stra8 与支持细胞共培养的Stra8-EGFP 表达结果
• 3.3.9 流式分选诱导细胞的GFP 阳性率
• 3.3.10 ES-Stra8 与支持细胞共培养的免疫荧光检测
• 3.3.11 细胞周期变化
• 3.3.12 苯胺兰（Aniline Blue）染色
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 小鼠ESC 诱导分化细胞移植治疗生精缺陷模型小鼠的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 主要溶液配制
• 4.2.2 生精缺陷性小鼠模型的制作
• 4.2.3 诱导细胞的DAPI 标记和移植
• 4.2.4 采样并观察两侧睾丸
• 4.2.5 镜下观察DAPI 标记细胞并培养
• 4.2.6 石蜡切片的制作和观察
• 4.3 结果
• 4.3.1 DAPI 标记诱导的细胞
• 4.3.2 移植侧和对照侧附睾精子
• 4.3.3 DAPI 标记细胞的观察
• 4.3.4 移植细胞的切片观察
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 创新点
• 进一步研究课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介