水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建

论文摘要

由立枯丝核菌（Rhizoctonia Solani）引起的水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一,几乎所有的稻田都会发生纹枯病,全世界平均每年因该病造成的损失稻谷达数十亿公斤。因此,对水稻纹枯病菌的研究具有非常重要的科学和实际意义。由于缺乏有效的遗传转化系统,对该病的研究主要集中在病菌的分类、抗性机制、病害流行与防治等研究。关于水稻纹枯病菌的遗传转化,国外已有了一些报道,国内则报道甚少。对于立枯丝核菌的转化效率,相关报道显示也是比较低,采用合适的启动子,是能否进行高效转化的关键因素之一,因此寻找水稻纹枯病菌高效启动子是提高其转化效率的一种途径。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GPD）在真核细胞中高效表达,如在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）其含量可达细胞内可溶蛋白的5%；在面包酵母中其mRNA的量占总mRNA量的2-5%。因此,GPD基因的启动子可能为一强启动子。而且在许多不同的真菌中,GPD基因启动子已经被成功地用来构建转化体系。本研究利用同源克隆及染色体步移策略,从水稻纹枯病菌基因组获得4613bp片段,NCBI序列同源分析该片段包含了GPD基因,暂命名为vsGPD,预测其全长为1531bp。通过RT-PCR扩增其CDS序列,分析显示其拥有10个内含子。Southern杂交结果显示,vsGPD在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝形式存在。vsGPD编码343个氨基酸的蛋白。蛋白序列同源性分析,vsGPD基因氨基酸同源性与立枯丝核菌国际标准融合群AG-3最高,达85.52%。此外,在不同融合群的立枯丝核菌中内含子的分布及大小具有高度相似性。根据vsGPD基因设计引物,扩增水稻纹枯病菌的GPD启动子通过TFSEARCH软件对GPD启动子片段进行分析,结果表明此序列含有TATA-box、CAAT-box、G-box、SP1-box及CT rich-motif等顺式作用元件。采用PlantCARE数据库及TFSitescan service软件分析GPD启动子片段,结果表明,该片段含有多个转录因子如ADR1、GATA-box、CCAAT-box、StuA-type、GCR1及GCN4等结合位点。以pCAMBIA1300X质粒为骨架,构建3个以水稻纹枯病菌GPD启动子启动潮霉素抗性基因的表达载体,其中2个载体的潮霉素基因做了如下改进,通过Over-lap PCR将潮霉素基因的5’端的160bp-195bp区间的AT转变为GC或在潮霉素基因两端添加水稻纹枯病菌的漆酶（Z54277）内含子。利用上述质粒,进行农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝体及菌丝球。最终在农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝球中,获得了转化子。然而这些转化子在继代培养中,潮霉素抗性性状,出现了丢失的现象。表型分析表明,这些转化子为非整合转化（Transient transformation）即DNA未整合至染色体上,而是游离在基因组之外,因而在生长或继代的过程中丢失。此外,转化子获得数量偏低,表明该遗传转化体系有待进一步优化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一部分 文献综述
• 第一章 水稻纹枯病菌研究概况
• 1 水稻纹枯病菌
• 2 水稻纹枯病症状
• 3 水稻纹枯病菌侵染循环与防治
• 4 水稻纹枯病菌侵染水稻的过程
• 5 水稻纹枯病菌的致病机理
• 第二章 丝状真菌转化的研究进展
• 1 丝状真菌遗传转化研究概况
• 2-PEG遗传转化方法'>1.1 CaCl₂-PEG遗传转化方法
• 1.2 电激法
• 1.3 限制酶介导的整合技术
• 1.4 醋酸锂转化
• 1.5 基因枪法转化
• 1.6 根癌农杆菌介导的转化
• 2 丝状真菌遗传转化的启动子与筛选标记
• 2.1 启动子
• 2.2 丝状真菌遗传转化的筛选标记
• 3 本课题研究目的与意义
• 第二部分 研究内容
• 第一章 水稻纹枯病菌GPD基因的克隆与序列分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第二章 水稻纹枯病菌GPD启动子的克隆
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化体系的建立
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果和分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录1:立枯丝核菌GPD基因的克隆与分析
• 附录2:缓冲液配方
• 附录3:培养基配方
• 附录4:Trizol法提取真菌RNA
• 附录5:大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 附录6:大肠杆菌的转化
• 附录7:碱法提取质粒
• 附录8:载体图
• 附录9:农杆菌的冻融法转化
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢