论文摘要
第一部分SCN5A基因点突变致病态窦房结综合征分子机制的研究目的SCN5A基因点突变E161K,T187I和L212P对Nav1.5通道的动力学以及通道蛋白转运的影响。方法采用定点突变的方法,得到含有E161K,T187I和L212P的SCN5A突变质粒,转染人胚胎肾293细胞（HEK293细胞）,用膜片钳记录Nav1.5激活,失活和恢复等通道动力学改变。在Nav1.5通道跨膜结构域Ⅰ的第一和第二个跨膜片段胞外连接处插入flag序列,与Nav1.5通道共表达,了解三个突变点对通道蛋白的转运是否有影响。结果正常钠通道在-20mv时,钠通道的电流最大,峰电流密度约为800pA/pF,激活曲线V1/2为-33.8±0.7 mV,斜率K为6.7±0.2;失活曲线V1/2为-80.3±0.9 mV,斜率K为6.2±0.1。T187I峰电流值减少约100%;E161K峰电流值减少约70%,L212P峰电流基本不变。E161K激活曲线明显右移,激活曲线斜率K为8.8±0.1mV,V1/2为-14.9±0.6mV,激活速度减慢,P<0.01;稳态失活曲线与正常接近,k为-6.5±0.2mV,V1/2为-78.4±0.8mV,通道失活不变。L212P其激活曲线明显左移,激活加快,激活曲线斜率k为8.4±0.2mV,V1/2为-14.9±0.6mV,通道激活速度加快,P<0.01;稳态失活曲线明显左移,曲线斜率k为-5.2±0.1mV,V1/2为-90.7±1.1mV,失活加快,P<0.01。E161K和L212P突变对通道的恢复无明显影响。三种突变通道上的Flag均能正常的表达在细胞膜上。结论T187I表现为Nav1.5通道失功能;E161K和L212P表现为Nav1.5通道功能减弱。三种突变Nav1.5通道均能被转运到细胞膜表面。第二部分Scn5a基因敲除小鼠模型的建立及鉴定目的建立Scn5a基因敲除杂合子（Scn5a +/-）小鼠模型。方法采用基因打靶技术,DNA同源重组的方法,建立Scn5a +/-小鼠模型。选择一组5月龄的同期培育的Scn5a +/-小鼠和正常野生型小鼠,取鼠尾提取DNA行PCR鉴定。分离小鼠的心室肌细胞,应用抗α-actin抗体鉴定分离下来的心室肌细胞。利用膜片钳技术记录Nav1.5通道电流。比较Nav1.5通道动力学的变化。结果PCR结果显示野生型小鼠在980Bp处出现一条带,而Scn5a +/-小鼠则在980Bp和650Bp处各出现一条条带。与正常野生型小鼠相比, Scn5a+/-小鼠心室肌细胞钠电流峰电流密度减少约45%（16±6PA/PF vs 34±8PA/PF,n=5,P <0.05）;其激活,失活曲线的半数有效电压和斜率均没有改变,无统计学差异。结论Scn5a +/-小鼠可以很好的被用来作为研究Nav1.5通道异常的疾病模型。第三部分Scn5a基因敲除小鼠心脏传导系统功能障碍的电生理研究目的探讨Scn5a基因敲除杂合子（Scn5a +/-）小鼠窦房结等传导系统功能障碍的原因。方法记录小鼠离体心脏的心表心电图,观察心率和节律的改变。通过电mapping了解窦房结发放冲动传导至外周冠状窦的时间。膜片钳技术检测小鼠窦房结细胞Nav1.5通道电流和功能。局部组织冰冻切片免疫组织化学检测窦房结区Nav1.5通道蛋白的表达。结果与野生型小鼠相比,Scn5a +/-小鼠的心率明显减慢（259±27 bpm VS 336±8 bpm,P<0.05,n=6）,并且该组小鼠间的心率变异度也大,并且出现2:1的房室传导阻滞;心表心电图上显示为P波时限（12.91±4.17ms VS 22.35±6.44ms, P<0.05,n=6）和PR间期延长（44.22±5.98ms VS 66.81±8.24ms, P<0.01,n=6） ;电mapping显示由窦房结发出的冲动传导到冠状窦的时间延长（8.16±1.36ms vs 3.56±0.26ms P<0.05,n=6）。Scn5a +/-小鼠窦房结细胞Nav1.5通道最大电流电流密度减小（36±1PA/PF vs 57±4PA/PF, P<0.05,n=5）,通道功能没有改变。免疫荧光的结果显示Scn5a +/-小鼠窦房结区Nav1.5通道蛋白表达减少。结论Nav1.5通道蛋白运输和表达障碍是导致Scn5a +/-小鼠Nav1.5通道电流减小,产生病态窦房结综合征的主要原因。
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