论文摘要
前言先天性全身终毛增多症（congenital generalized hypertrichosis terminalis,CGHT）是一种非常罕见的疾病,发病率未知,已报道的CGHT发病率大约在十亿分之一。其特点是非雄激素依赖性全身性毛发过度生长,且不受性别、年龄和人种限制,也就是人们常说的“狼人综合征”、“毛人”或者“毛孩”现象。从中世纪开始,在不少文学和绘画作品中就有对CGHT患者的记载和描绘,可见普通大众和科学家们一样,都对此拥有极其浓厚的兴趣。在达尔文时代,人们认为“毛人”是由猿向人进化的中间阶段,因此把这种现象称做“返祖现象（atavism）”,并将其作为进化论的证据之一。但几百年来,返祖现象的产生原因一直是一个悬而未决的科学之谜。从目前研究结果来看,包括CGHT在内的大部分“返祖”患者实际上是罹患了一种由未知的遗传缺陷引起,以表现类似人类祖先表型为特征的遗传病。因此找到导致CGHT发病的生物学基础,将有助于科学的解释这一历史悠久的自然之谜。由于CGHT患者极少,具有良好研究价值家系十分罕见,加上CGHT致病基因具有高度遗传异质性,所以给候选基因定位研究带来困难。而传统的微卫星全基因组连锁分析无法定位连锁区域较小的家系。所以深入的遗传学研究结果一直鲜有报道。随着有高度学术研究价值的家系的收集,以及近年来刚刚兴起的高分辨率基因芯片技术和全基因组连锁分析技术的应用,在全基因组范围内定位CGHT致病基因候选区并进一步研究其发病机制成为了一种可能。遗传物质DNA的很多种改变都会导致遗传病的发生。近年来科学家们检测到一种新的基因组变异形式,DNA片段拷贝数变异（copy number variation,CNV）。CNV是指大于1kb以上的DNA片段的缺失、插入、重复等,它既可以是普通多态也可以是病理性的。病理性CNV研究是以往的遗传病致病机制研究所未涉及的一个全新领域。当病理性CNV的存在导致某些剂量敏感基因发生缺失、重复、结构完整性破坏或者通过远程位置作用影响CNV区域以外的基因表达时,将造成这些基因获得功能、失去功能或者功能紊乱从而导致基因组疾病（genomic disorder）发生。我们通过使用这些目前国际领先的研究技术对收集到的三个CGHT家系进行基因定位研究,并进一步对其致病原因进入深入探讨。材料与方法1、家系资料收集家系,对家系中可能追溯到的家庭成员经知情同意后进行详细表型分析,绘制家系系谱图,采集外周静脉血,提取基因组DNA。2、对已知有关染色体区域的排除性定位分析首先根据国际上已发表的文献,对已知的3号和8号染色体相关区域进行排除性分析。利用UCSC基因组生物信息学网站在候选区内选择4对微卫星多态标记,PCR扩增家系1（SY）所有成员相应标汜,PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染,读出每个个体标记的基因型。再根据个体基因型和系谱中的亲缘关系,按照孟德尔遗传定律推导出同一条染色体上不同标记构成的单体型来进行定位分析。3、芯片全基因组扫描定位致病基因候选区根据实验手册标准流程,利用包含了57,244个SNP的Affymetrix GeneChip（?）Human Mapping 50K Array Hind 240,对四代19人家系1（SY）,进行全基因组扫描。扫描后数据用Affymatrix GeneChip Operating Software（GCOS）和AffymatrixGeneChip Genotyping Analysis Software（GTYPE 4.0）处理。结果输出成后续软件所兼容的格式,进行进一步数据分析。4、全基因组连锁分析在常染色体显性遗传模式下,设定外显率99%,疾病等位基因频率0.1%,默认SNP频率,用dChip连锁分析软件进行多点参数连锁分析。然后使用MERLIN,GENEHUNTER,SIMWALK2等连锁分析软件在验证和定位致病基因候选区。5、验证和精确定位致病基因候选区根据基因组扫描所提供的位置信息结果,在染色体17q24.2-q24.3上选取微11个卫星多态标记,分别对三个家系进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,单体型分析,来验证和精细定位致病候选区。6、候选基因DNA测序突变筛查根据在连锁和单体型分析确定的候选区域中选取候选基因进行引物设计,PCR扩增候选基因编码区,PCR产物纯化后测序。7、比较基因组杂交实验进行拷贝数变异分析每个家系选取一个患者,取1ml EDTA抗凝外周血,送上海生物芯片中心,用Affymatrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片进行比较基因组杂交实验。严格依据实验手册进行实验,用Affymatrix Genotyping Console 3.0进行质量控制、基因分型和拷贝数变异分析,结果分别输出成*.txt和*.cnchp格式,供进一步分析使用。并在公共数据库（database of genomic variations）以及434个无关汉族正常对照（数据由上海交通大学提供）中检索拷贝数变异情况。8、定量PCR检测基因组拷贝数变异应用Primer Express v2.0软件,针对三个家系成员的拷贝数变异区,设计11对实时定量PCR引物,扩增相应片段,检测拷贝数变异情况。9、统计学分析应用SPSS 14.0进行相关的数据分析,SNP和CNV算法内嵌在相关软件内,P＜0.05为有显著性差异。实验结果1、家系资料根据患者的临床表现,确定本实验所收集的三个中国汉族家系是典型的常染色体显性遗传CGHT家系。2、对已知有关染色体区域的排除性定位分析通过连锁分析,排除3号染色体和8号染色体上选取的微卫星标记D8S1128、D8S1466、WNT5-CA、LRTM1-CCTT与致病基因相连锁。3、芯片全基因组扫描Affymetrix GeneChip（?） Human Mapping 50K Array Hind 240芯片试验和全基因组连锁分析结果将家系1（SY）的致病基因候选区定位在染色体17q24.2-q24.3（64.37Mb-67.73Mb）内。在此区间内有ABCA8、ABCA9、ABCA6、ABCA10、ABCA5、MAP2K6、KCNJ16、KCNJ2和SOX9共9个编码蛋白的基因。4、验证和精确定位致病基因候选区在染色体17q24.2-q24.3的11个微卫星标记单体型分析显示在这三个CGHT家系中这些微卫星标记与致病基因相连锁（在D17S2182上,最大Lod值3.9）,与全基因组连锁分析结果一致。同时发现在D17S2182和D17S1786之间所有患者均存在等位基因缺失,提示患者在该区域内存在拷贝数降低情况。5、比较基因组杂交实验进行拷贝数变异分析在17q24.2-q24.3上三个家系分别存在拷贝数降低变异,降低范围是（SY:64.33Mb-65.33Mb,GD:64.5Mb-65.19Mb,BJ:64.48Mb-65.22Mb）。检索公共数据库和434个无关汉族正常对照（数据由上海交通大学提供）,未见此区域中存在拷贝数变异。6、候选基因DNA测序突变筛查对致病基因候选区内的SOX9的全部外显子以及部分保守序列测序未发现异常的碱基改变。7、定量PCR检测基因组拷贝数变异实时定量PCR分析显示这三个家系均存在拷贝数降低现象范围与芯片实验结果相一致,并且拷贝数降低与疾病完全共分离。三个家系共同缺失区域所包括的基因有:ABCA6（MIM 612504）、ABCA10（MIM 612508）、ABCA5（MIM 612503）和MAP2K6（MIM 601254）。结论（1）三个中国汉族常染色体显性遗传CGHT家系致病基因定位在染色体17q24.2-q24.3区域内。（2）常染色体显性遗传的CGHT是一种基因组疾病,包含ABCA5、ABCA6、ABCA10和MAP2K6在内的这一区域拷贝数突变是导致该病的致病原因。（3）本实验所搭建的以dChip为核心的芯片全基因组连锁分析平台可以广泛的应用到单基因遗传病分析领域中。（4）比较基因组杂交实验结合实时定量PCR技术是检测CNV的有效手段。
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