论文摘要
形态发生是指胚胎细胞分化成形态和结构不同的组织和器官的过程。牛蹄皮肤附属物包括围绕蹄末端趾骨的角质化结构与皮肤,研究牛蹄皮肤附属物的形态发生,不但对于阐明发育生物学的热点问题,器官形态发生中上皮-间充质的相互作用机制具有重要的理论意义,其研究成果对于毛囊生物学、干细胞生物学和再生医学也具有潜在的应用前景。本实验用牛胚胎作为实验材料,用石蜡切片,HE染色法系统地研究了牛蹄皮肤附属物发育的组织形态学;用免疫组化定性检测了β-catenin在牛蹄皮肤附属物形态发生中的表达,探讨了其表达的规律,构建牛蹄真皮乳头cDNA表达文库,为研究牛蹄皮肤附属物的形态发生奠定了的研究基础。实验的结果与结论如下:⒈牛蹄皮肤附属物形态发生的组织形态学研究应用HE染色法观察牛蹄形成过程中真皮、表皮及牛蹄边缘毛囊的形态发生规律。结果显示:（1）真皮乳头最早出现在胚龄60天的蹄冠、蹄壁处,蹄壁处的真皮乳头与表皮互相嵌合,形成真皮小叶,且随着蹄的发育,嵌合越来越深;蹄底处的真皮乳头最早出现在胚龄70天,胚龄71-90天,蹄底处真皮乳头逐渐变粗变深,胚龄90天左右,真皮乳头开始出现第一次分叉,分叉之后,其数目、粗度、长度都增加,胚龄91-225天,在经过若干次分叉增殖过程之后,蹄底处真皮乳头数目、粗度、长度达到最大;蹄缘处的真皮乳头最早出现在胚龄75天左右,在牛蹄发育过程当中,在数量及大小方面都不及牛蹄其他部位的真皮乳头。（2）在胚龄70天,表皮增厚,向上突起;胚龄93天,出现了第一个毛芽,基板出现,上皮、间充质细胞清晰可见;胚龄106-174,可见毛芽、毛钉;胚龄210天,形成结构完全的初级毛囊;胚龄230天毛囊完全成熟。另外,所有的基板、毛芽、毛钉和毛囊都沿远离蹄方向呈梯形排列,离蹄部越近,发育越早,离蹄部越远,发育越晚。（3）牛蹄皮肤附属物出现的先后顺序为:蹄冠、蹄壁真皮乳头→蹄底真皮乳头→蹄缘真皮乳头→毛囊基板→毛芽→毛钉→毛囊;胚龄191天是一个转折点,此前毛囊、真皮乳头、表皮持续发育,表皮一直增厚,此后毛囊的发育限制了牛蹄边缘皮肤的发育,毛囊和牛蹄真皮乳头继续发育,而皮肤持续变薄。2.β-catenin在牛蹄皮肤附属物形态发生中的表达应用免疫组化方法定性检测β-catenin在胎牛蹄边缘毛囊及真皮、表皮发育过程中表达的时空变化。结果显示:（1）β-catenin在牛蹄真皮及表皮形成过程当中持续表达,在牛蹄所有部位的基底层,胚龄68-93天,由弱阳性变为强阳性,在蹄缘,蹄冠,蹄壁,蹄尖基底层,胚龄106-167天,184-225天由中阳性变为强阳性;在蹄缘,蹄冠,蹄壁,蹄尖表皮层,胚龄胚龄68-167天,由弱阳性变为中阳性,胚龄184-225天,由弱阳性变为强阳性;蹄底处真皮乳头分叉初期基底层为强阳性,分叉中后期为弱阳性;在牛蹄所有真皮乳头中未见β-catenin表达;我们还在牛蹄发育的晚期（胚龄196天以后）的样品中发现了β-catenin的核内表达,此处β-catenin可能起着促进角质化细胞增殖分化的作用;其特有的时空变化规律提示β-catenin以其特有表达规律在胎牛蹄真皮及表皮形成过程中发挥着重要作用。（2）β-catenin在胎牛蹄边缘毛囊发育早期（胚龄68-93天）表达于毛芽、基板、表皮和基底层中,其中在毛芽、基板、基底层中呈强阳性,表皮中呈中阳性;在毛囊发育中期（胚龄94-184天）表达于毛钉、表皮和基底层中,其中在隆突区、内外根鞘、漏斗部、表皮和基底层呈中阳性;在毛囊发育晚期（胚龄184-225天）只在表皮及基底层有表达,其中在基底层中呈弱阳性,表皮中呈强阳性。β-catenin表达的时空变化规律提示其在胎牛蹄边缘毛囊的形态发生过程中具有持续且重要的作用。（3）β-catenin在牛蹄真皮层无表达;在胚龄68-93天,在牛蹄表皮基底层和牛蹄边缘表皮基底层中,表达逐渐增强至强阳性,这说明牛蹄皮肤附属物形态发生过程中β-catenin的表达具有一定的同步性。3.成功构建牛蹄真皮乳头cDNA表达文库构建了牛蹄真皮乳头cDNA表达文库,为进一步筛选、克隆牛蹄真皮乳头特异性表达的基因、阐明牛蹄表皮附属物形态发生的基因调控和分子机制奠定研究基础。