论文摘要
[目的]本课题设计将姜黄素作为抗肿瘤药物在光照条件下激发成为光敏剂,通过修饰后偶联特异性的抗TfR抗体协同发挥双向抗癌效应。为了延长药物的半衰期,进一步探索姜黄素的光学特性,比较了TfR抗体与光敏剂联合应用的不同方法,检测其偶联效率及体外功能,探讨作用机制,并据此设计制备纳米化中药光敏剂-抗TfR单抗偶联物,为肿瘤的多重定位显像与靶向治疗提供实验依据。在此基础上还分析了从同一杂交瘤细胞株中扩增出的三条轻链基因,为实现抗TfR基因工程改造与基因工程抗体靶向偶联物抗瘤效应研究奠定基础。[方法]1.抗TfR单抗-偶联物的制备及其抗瘤效应测定（1）研究姜黄素光敏特性及荧光显微镜观察肝癌细胞内吞Cur；（2）以碳二亚胺为缩合剂制备Cur-Ab免疫偶联物,间接ELISA测定偶联物抗体效价,MTT法测定其IC50；（3）光敏化姜黄素-抗TfR单抗靶向性纳米粒的制备及效应测定：1)薄膜法和注入法制备脂质体,色谱法测定其包峰率；2) TfR mAb修饰的姜黄素脂质体的制备；3)扫描电镜观测脂质体姜黄素外形及粒径大小；4)FCM检测Cur-NP-PEG-Ab与肝癌细胞的结合率；5)FCM检测Cur-NP-PEG-Ab在光照和非光照情况下对肝癌细胞增殖/凋亡,周期等的影响；6)分别由DCFH-DA荧光探针和罗丹明染色试剂盒检测线粒体电位和细胞活性氧的变化。2.抗TfR单抗轻链基因分析（1）采用PCR法从分泌抗TfR单抗杂交瘤细胞中扩增抗体可变区序列；（2）通过IMGT和NCBI数据库在线分析VH和VL基因序列；（3）经由Insight II软件模拟抗TfR单抗Fabs段分子结构。[结果]1.抗TfR单抗-偶联物的制备及其抗瘤效应（1）普通光照对细胞培养无影响,姜黄素在电镜下能发出土黄色荧光,在灯光照射下对肿瘤细胞原有的杀伤作用增强,荧光显微镜下可见Cur能被肝癌细胞内吞；（2）化学偶联法制备的抗TfR单抗-姜黄素偶联物,其抗体效价较单抗有所降低,但对HepG2肝癌细胞的杀伤作用比姜黄素或抗TfR单抗单独作用时明显增强,与姜黄素+单抗混合物杀伤作用类似；（3）光敏化姜黄素-抗TfR单抗靶向性纳米粒的性质、特征均符合纳米级颗粒：1)薄膜分散法制备的脂质体包封率稳定；2)扫描电镜显示Cur-NP-PEG-Ab形态稳定,属于纳米级；3)FCM分析结果表明Cur-NP-PEG-Ab与鼠源单抗具有相似的结合率；4)FCM分析结果表明在光照条件下Cur-NP-PEG-Ab能影响肝癌细胞的周期S期,并促进其凋亡；5) Cur-NP-PEG-Ab使线粒体电位降低和活性氧产生增加。2.抗TfR抗体基因分析在分泌抗TfR单克隆抗体的同一株杂交瘤细胞中扩增出三条轻链和一条有功能的重链可变区基因,功能性的VH基因片段经DNA凝胶电泳鉴定片段大小与理论值414bp相符,DNA测序显示该基因有完整阅读框架。得到的三条轻链通过IMGT和NCBI分析确认均来自于不同的基因家族：VL-fl引物扩增得到MOPC21骨髓瘤中的非功能内源性轻链;由VL-f2引物扩增出有功能的轻链基因（命名为Vκ2）,属于IGKV4-59*0 1家族,可变区长318bp,信号肽长66bp；由VL-f3引物扩增出的功能性轻链基因（命名为Vκ3）,属于IGKV6-17*01,可变区长324bp,信号肽长60bp。NCBI数据库报道Vκ3序列与许多单抗轻链可变区相同,也与骨髓瘤MPC11有功能的重排等位基因完全匹配。3D分子模拟显示根据TfR单抗可变区模拟的Fabs结构,两条不同轻链和同一重链偶联制备的Fabs段都具有完整的功能域和结合凹槽。[结论]本研究通过制备可生物降解的mPEG-PLGA-CUR-NPs纳米颗粒,并通过体外实验初步研究了改造的纳米粒生物学作用,获得了有意义的研究结果,研究表明：①制备的Cur-NP-PEG-Ab纳米粒符合纳米级别,具有较高的载药量和包封率；②Cur-NP-PEG-Ab与靶细胞结合率和亲本鼠源性抗体与HepG2细胞结合率相近；③Cur-NP-PEG-Ab在光照下对肿瘤细胞杀伤作用明显增强,提示该纳米粒在完成靶向杀伤肿瘤的同时,能发挥光敏剂的效应；④首次将Cur-NP-PEG-Ab中的姜黄素作为中药光敏剂,脂质体包裹的姜黄素纳米粒,能在体内发挥延长代谢的作用,经过体内循环后,脱去脂质体外衣的姜黄素,又能接着发挥中药本身的抗癌效应。并在此基础上分析了从同一杂交瘤细胞株中扩增出的三条轻链基因,为进一步抗体改造奠定了基础。
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