Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137中二硫吡咯酮类抗生素生物合成基因簇克隆

论文摘要

S.algeriensis NRRL B-24137可以产生多种二硫吡咯酮类化合物,这些次级代谢产物对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和酵母都有很好的抑菌活性。B-24137产生二硫吡咯酮类化合物的种类和产量与培养基密切相关。本研究以B-24137为研究材料,通过建立B-24137的基因组cosmid文库,设计硫氧还原蛋白还原酶基因的特异性引物进行文库筛选,得到12个阳性cosmid。将阳性cosmid分别导入变铅青链霉菌ZX1和白色链霉菌中进行异源表达,但均未成功。从B-24137的基因组序列中我们找到了可能的二硫吡咯酮类化合物的生物合成基因簇。通过生物信息学分析发现该基因簇与Streptomycesclavuligerus中holomycin生物合成基因簇和Streptomyces thioluteus中thiolutin生物合成基因簇具有一定的相似性。B-24137中二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇缺失了编码独立的Cy和TE结构域的基因。这两个基因在holomycin和thiolutin生物合成基因簇中已被证实是必不可少的。B-24137属于糖丝菌属,到目前为止尚无与糖丝菌遗传操作有关的报道。本研究以大肠杆菌S17-1和ET12567（pUZ8002）为供体宿主菌,以整合型质粒pSET152和自主复制型质粒pKC1139作为转移质粒,对B-24137的接合转移方法进行了探索。尝试了不同的接合转移条件,包括培养基、供受比、孢子热激温度、覆盖时间和镁离子浓度等,均未发现有接合子产生。但以所筛选到的cosmid为转移质粒时,成功地获得了接合子。B-24137遗传操作系统的建立将为后期二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇的研究带来便利,对于糖丝菌的遗传学研究也具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137简介
• 1.1.1 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137遗传学分类
• 1.1.2 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137生理生化特性
• 1.1.3 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137的抑菌活性
• 1.2 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137的喂养实验
• 1.3 二硫吡咯酮类化合物
• 1.3.1 二硫吡咯酮类化合物的结构及种类
• 1.3.2 二硫吡咯酮类化合物的生物活性
• 1.4 Holomycin生物合成的研究
• 1.5 放线菌的遗传操作方法
• 1.5.1 接合转移
• 1.5.2 电转化
• 1.6 研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验用菌株
• 2.2 实验用质粒和引物
• 2.3 实验用培养基
• 2.4 试剂
• 2.4.1 分子生物学试剂
• 2.4.2 缓冲液和溶液
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 链霉菌培养及菌种保藏
• 2.5.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.5.3 脉冲场凝胶电泳
• 2.5.4 提取链霉菌基因组DNA
• 2.5.5 链霉菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.5.6 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137基因组DNA提取
• 2.5.7 菌落原位杂交
• 2.5.8 接合转移
• 2.5.9 Cosmid文库建立
• 2.5.9.1 基因组DNA的Sau3AI部分酶切
• 2.5.9.2 DNA片段回收
• 2.5.9.3 载体处理
• 2.5.9.4 连接
• 2.5.9.5 包装
• 2.5.9.6 效价测定和文库阳性检测
• 2.5.9.7 文库的扩增和独立保存和混合
• 第三章 Saccharothrix algeriensis NRRLB-24137中二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇的克隆
• 3.1 结果与分析
• 3.1.1 硫氧还原蛋白还原酶基因特异性引物的设计
• 3.1.2 基因组文库的构建
• 3.1.3 通过PCR对文库进行筛选
• 3.1.4 阳性克隆子在白色链霉菌中的异源表达
• 3.1.5 通过菌落原位杂交对文库进行复筛
• 3.1.6 混合文库的建立及筛库
• 3.1.8 阳性克隆在变铅青链霉菌ZX1中的异源表达
• 3.1.9 二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇的序列分析
• 3.1.9.1 二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇的ORF分析
• 3.1.9.2 二硫吡咯酮类化合物生物合成基因簇的比较分析
• 3.2 讨论
• 第四章 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137遗传操作系统的建立
• 4.1 结果与分析
• 4.1.1 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137抗生素敏感性的测定
• 4.1.2 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137的接合转移
• 4.1.2.1 培养基的选择
• 4.1.2.2 供受比的调整
• 4.1.2.3 热激温度
• 4.1.2.4 覆盖时间
• 4.1.2.5 镁离子浓度对接合转移的影响
• 4.1.3 使用携带有同源片段的质粒进行接合转移
• 4.1.4 Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137电转化的尝试
• 4.1.4.1 电转化感受态的制备
• 4.1.4.2 电转化
• 4.2 讨论
• 第五章 链霉菌SH-4的初步研究
• 5.1
• 5.1.1 链霉菌SH-4的生物活性测定
• 5.1.2 链霉菌SH-4的16S rDNA分析
• 5.1.3 链霉菌SH-4基因组中PKS/NRPS基因的扫描
• 5.1.4 链霉菌SH-4的抗性背景测定
• 5.1.5 链霉菌SH-4的接合转移
• 5.2 讨论
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢