论文摘要
本研究利用cDNA-AFLP技术、消减文库的构建进行水稻应答稻纵卷叶螟取食的基因表达谱或基因差异展示研究,并利用实时荧光定量PCR技术对部分重要候选基因差异表达进行验证,选取一个重要的候选基因构建了其超表达载体,主要研究结果如下:1、水稻应答稻纵卷叶螟取食和MeJA处理转录谱的cDNA-AFLP分析。使用16对引物组合对应答稻纵卷叶螟取食和MeJA处理的水稻进行转录谱的cDNA-AFLP分析,共获得约12000 TDFs。选取差异明显的240条TDFs测序,197个找到对应的基因序列。得到164个不重复的差异TDFs,其中,154个TDFs在稻纵卷叶螟取食作用下表达发生改变,94个发生上调,它们对应的基因主要有生长素输出载体家族蛋白、伴侣蛋白、早期应答脱水蛋白、PHD锌指蛋白等,60个发生下调,它们对应的主要基因有RNA聚合酶beta亚基2、类枯草杆菌蛋白酶、热激蛋白等;119个TDFs在外源MeJA作用下表达发生改变,其中70个TDFs发生上调,它们对应的基因主要有RNA聚合酶beta亚基2、PHD锌指蛋白、病程相关蛋白5前体、NB—ARC结构域蛋白、铁氧还蛋白以及早期应答脱水蛋白等,49个发生下调,它们对应的基因主要有生长素输出载体家族蛋白、热激蛋白等。在水稻叶片接种稻纵卷叶螟幼虫2h后,就发现68个差异表达的TDF,对应的是水稻早期应答稻纵卷叶螟取食的基因。在稻纵卷叶螟取食和外源MeJA作用下,发现水稻叶片中有42个TDFs共同上调,它们主要有PHD锌指蛋白、生长素抑制蛋白、早期应答脱水蛋白等,12个TDFs共同下调,它们主要有类脯氨酰羧肽酶蛋白、核酮糖磷酸盐羧化酶主链蛋白前体、热激蛋白等。2、构建了水稻响应稻纵卷叶螟取食的抑制消减文库。SSH文库是一种简便而高效的差异表达基因筛选技术,该技术通过两轮差减杂交和两次抑制性PCR,使差异表达基因得到有效的富集并得以克隆,在分离克隆差异表达基因的应用上表现出了独特的优越性。从中挑取135个克隆进行PCR扩增并测序,得到33个不重复的差异表达基因的cDNA克隆,其中有13个cDNA克隆与cDNA-AFLP的结果相一致,如生长素抑制蛋白、丙胺酸转移酶、光诱导蛋白及NAC转录因子等。3、应用荧光定量技术对水稻应答稻纵卷叶螟取食的4个TDFs对应的基因表达进行检测。结果表明,与TDF501对应的PP2C基因、与TDF518对应的膜关联盐胁迫蛋白基因和与TDF974对应的PHD锌指蛋白基因等在稻纵卷叶螟取食2h后开始表达,6h大量表达,随后稍有减弱,这三个基因在MeJA处理后表达很弱;与TDF764对应的铁氧还蛋白基因在虫取食后变化不大,但在MeJA处理后大量表达。荧光定量结果与cDNA-AFLP结果相比较,除铁氧还蛋白TDF764略有差异外,其余均一致,说明cDNA-AFLP转录表达谱研究结果较为稳定可靠。4、挑选一个水稻应答稻纵卷叶螟取食的膜关联盐诱导蛋白基因（TDF518）。通过Gateway载体构建技术进行载体构建,获得了此基因的入门克隆和目的载体。