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丙型肝炎病毒非结构蛋白4A、4B与肝细胞相互作用的机制研究

2020-11-22阅读(406)

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A、4B与肝细胞相互作用的机制研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化和肝细胞癌的发生发展进程密切相关。病毒感染肝细胞后,病毒的核酸、蛋白与肝细胞的核酸、蛋白等生物大分子之间的相互作用是病毒致病的主要分子机制之一。HCV基因组长约9.6kb,含有一个长的开放阅读框架（ORF）,编码一个约3010～3033个氨基酸残基（aa）的多蛋白前体,经宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶加工成至少十种结构蛋白和非结构蛋白,C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。目前还发现核心蛋白C的编码基因通过移框从而编码一种新的17kD的F蛋白,这些蛋白在病毒的复制和繁殖中各有不同的功能,但某些具体机制尚不清楚。本研究以两个非结构蛋白NS4A、NS4B为研究对象,旨在探讨HCV NS4A和NS4B蛋白对肝细胞基因表达谱的调节及与肝细胞蛋白之间的相互作用,对于了解HCV NS4A、NS4B蛋白的致病机制及寻找有效防治HCV的方法具有重要意义。 为研究NS4A、NS4B蛋白的反式激活功能,我们构建了NS4A、NS4B的真核表达载体pcDNA3.1（-）-NS4A和pcDNA3.1（-）-NS4B,分别将其与氯霉素乙酰转移酶报告基因表达质粒pCAT3-Promoter（含有SV40早期启动子）共转染人肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因的表达活性;以表达质粒pcDNA3.1（-）-NS4A和pcDNA3.1（-）-NS4B转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1（-）为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）,构建HCV NS4A、NS4B反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,对筛选的克隆进行测序及同源性分析。结果发现,NS4A、NS4B能够反式激活SV40启动子的转录活性,进而促使其调控的下游CAT基因表达增强,NS4B的反式激活作用强于NS4A。消减杂交分析显示,NS4A、NS4B能够上调肝细胞中多种基因的表达,包括与细胞生长调节、细胞内信号转导、蛋白质翻译合成、肿瘤发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因;此外,我们还筛选到两个新基因,分别命名为NS4A反式激活

论文目录

  • 英文缩略语表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 主要仪器设备
  • 第一部分 HCV NS4A、NS4B蛋白反式调节肝细胞基因表达谱的研究
  • 第一节 HCV NS4A、NS4B真核表达载体的构建及其反式激活SV40即刻早期启动子的研究
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 第二节 抑制性消减杂交技术筛选HCV NS4A、NS4B蛋白反式调节基因
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 第二部分 HCV NS4A、NS4B蛋白与肝细胞蛋白之间相互作用的研究
  • 第一节 HCV NS4A、NS4B酵母“饵”载体的构建及在酵母细胞中表达的研究
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 第二节 酵母双杂交实验筛选HCV NS4A、NS4B蛋白的肝细胞结合蛋白
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 第三部分 HCV NS4A蛋白反式激活新基因的克隆化及在细胞内表达的研究
  • 第一节 HCV NS4A反式激活蛋白NS4ATP1和NS4ATP2的基因克隆化及生物信息学分析
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 第二节 NS4ATP1和NS4ATP2在原核大肠杆菌和真核酵母细胞中表达的研究
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 结论及展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 文献综述
  • 附录 在读期间发表和撰写的论文

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