凉山半细毛羊QM基因的克隆、组织表达及生物信息学分析

论文摘要

QM基因是一种与肿瘤抑制,细胞生长,分化,发育和凋亡等有关的重要基因。QM同源基因广泛地存在于动物、植物以及真菌,目前已在小鼠、鸡、果蝇、牛、酵母、玉米和水稻等生物中克隆了QM同源基因,这些基因的核苷酸及其编码的氨基酸序列高度保守。迄今为止,绵羊中尚未见QM基因的相关报道。本研究首次从凉山半细毛羊基因组中克隆出QM基因,并构建出QM基因分子进化关系,为QM的分子进化以及生物学功能的深入研究打下基础。本研究应用电子克隆的方法,克隆出绵羊QM基因,并构建15个物种间QM基因分子进化关系。同时利用QM基因的保守区域,设计了特异性引物,克隆出凉山半细毛羊QM同源基因,命名为SQM（GeneBank登陆号:EU143791）,并对其进行了生物信息学分析。SQM基因全长771 bp,含有一个最长为645 bp的完整的开放阅读框,5’UTR长度为70 bp,第71位到716位为ORF,长645 bp,编码214个氨基酸,3’UTR长度为55 bp,在754 bp—759 bp区域内有一个AATAAA加尾信号。SQM基因编码的多肽,预测其分子量大小为24.61 kDa,等电点pI为10.6,其中Asp和Glu酸性氨基酸残基数为7.9%,碱性氨基酸Arg和Lys残基数为20.92%,表明绵羊QM基因蛋白为碱性蛋白质。预测SQM蛋白二级结构有6个α螺旋区,富含10个β折叠片,其余部分为无规卷曲。绵羊QM基因和牛QM基因在进化上的距离最短,同时也发现QM基因具有极大的保守性。采用数字化差异显示分析,对绵羊EST数据库中主要组织细胞如脑、淋巴网状内皮细胞、肾、脾脏、肝脏、肠和肌肉中QM的表达进行了研究,探讨了SQM基因在不同器官之间、正常组织与病变组织之间的表达情况。发现QM基因在脾脏和淋巴网状内皮细胞中的表达量大于其他组织,在病变组织中的表达强于在正常组织中的表达。同时,QM基因在绵羊骨组织分化细胞中也有较强表达,推断QM基因与绵羊的免疫调控,细胞分化有密切的关系。采用RT-PCR方法,选取凉山半细毛羊肝脏,肾脏,心脏和肌肉等四个组织,通过酶标仪定量,进行了QM基因的表达分析,在凉山半细毛羊中,QM基因在心脏和肝脏有较强表达,初步推断它与凉山半细毛羊心脏功能有密切关系,值得深入研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1 生物信息学
• 1.1 生物信息学
• 1.2 基因的电子克隆
• 2 生物信息学算法
• 2.1 BLAST算法
• 2.2 序列拼接
• 2.3 FISHER'S EXACT TEST
• 2.4 分子进化算法
• 3 QM基因及其研究进展
• 3.1 QM基因克隆及分析
• 3.2 QM基因的亚细胞定位
• 3.3 QM的生物学功能
• 3.3.1 QM基因编码核糖体蛋白
• 3.3.2 转录调节因子的活性
• 3.3.3 QM与细胞的分化、生长
• 3.3.4 肿瘤抑制作用
• 4 基因的组织表达分析
• 5 凉山半细毛羊
• 6.本研究的目的及意义
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 样品的采集
• 1.2 实验主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 计算机资源及应用软件
• 1.4.1 计算机配置
• 1.4.2 主要数据库
• 1.4.3 生物信息学软件
• 2 实验方法
• 2.1 绵羊QM基因的电子克隆
• 2.1.1 探针基因的获得
• 2.1.2 获得绵羊同源EST片段
• 2.1.3 重叠群组装
• 2.1.4 获得全长cDNA
• 2.2.凉山半细毛羊QM基因克隆
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 双链cDNA合成
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.5 凉山半细毛羊QM基因测序
• 2.3 凉山半细毛羊QM基因组织表达分析
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 总RNA质量测定
• 2.3.3 磁珠纯化mRNA
• 2.3.4 反转录反应
• 2.3.5 PCR反应
• 2.3.6 表达产物酶标定量
• 2.4 凉山半细毛羊QM基因及其蛋白的生物信息学分析
• 2.4.1 SQM基因ORF预测
• 2.4.2 SQM基因内含子/外显子剪切位点识别
• 2.4.3 SQM基因调控区域CpG岛分析
• 2.4.4 SQM基因限制性核酸内切酶位点分析
• 2.4.5 SQM蛋白氨基酸组成、分子量、等电点分析
• 2.4.6 SQM蛋白跨膜区分析
• 2.4.7 SQM蛋白疏水性分析
• 2.4.8 SQM蛋白二级结构预测
• 2.4.9 SQM蛋白三级结构预测
• 2.5 绵羊QM基因的数字化差异表达分析
• 2.6 QM基因同源分析
• 2.6.1 不同物种QM同源基因下载
• 2.6.2 多序列比对
• 2.6.3 构建进化树
• 结果与分析
• 1 绵羊QM基因的序列的电子克隆
• 2.凉山半细毛羊QM基因克隆
• 2.1 PCR产物的检测
• 2.2 凉山半细毛羊QM基因序列
• 3.凉山半细毛羊QM基因组织表达分析
• 3.1 总RNA质量测定及定量
• 3.2 组织表达分析
• 3.2.1 RT-PCR结果
• 3.2.2 定量结果
• 4.凉山半细毛羊SQM基因的生物信息学分析
• 4.1 SQM基因ORF预测
• 4.2 SQM基因内含子/外显子剪切位点
• 4.3 SQM基因调控区域CPG岛分析
• 4.4 SQM基因限制性核酸内切酶位点分析
• 4.5 SQM蛋白氨基酸组成,分子量及等电点
• 4.6 SQM编码蛋白跨膜结构分析
• 4.7 SQM编码蛋白疏水性分析
• 4.8 SQM蛋白的二级结构预测
• 4.9 SQM蛋白三级结构预测
• 5 绵羊QM基因的数字化差异表达分析
• 6.QM基因同源分析
• 讨论
• 1.绵羊QM基因序列
• 2 凉山半细毛羊QM基因全序列及其生物信息学分析
• 3 绵羊QM基因的数字化差异表达分析
• 4 凉山半细毛羊QM基因组织表达分析
• 5 凉山半细毛羊QM基因同源分析
• 结论
• 1 首次克隆出凉山半细毛羊QM基因
• 2 建立了绵羊功能基因电子克隆的方法
• 3 初步分析凉山半细毛羊QM基因功能
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文