荣昌猪、内江猪白细胞介素-10基因的克隆与原核表达研究

论文摘要

本试验根据GenBank上发表的猪IL-10（interleukin-10，IL-10）基因序列（登陆号：L20001）设计并合成了特异性引物，经ConA（刀豆蛋白素A）诱导的荣昌猪、内江猪外周血单核淋巴细胞（PMBC），并提取的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增出两条为771bp的目的片段，并将其克隆到PMD18-T载体上，经酶切鉴定和序列测定证明该两条序列分别为荣昌猪、内江猪IL-10。开放阅读框由528个核苷酸组成，推测产生的编码产物由175个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现，荣昌猪IL-10与内江猪IL-10之间的核苷酸同源性为99.2％，两个地方品种猪的IL-10与GenBank已发表的IL-10序列的同源性较高，都为99.6％，荣昌猪与内江猪间IL-10氨基酸的同源性为98.7％。设计一对引物亚克隆荣昌猪IL-10成熟蛋白编码基因（477bp），利用基因重组技术构建了PET32a（+）—PIL-10融合表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用1mM的IPTG进行诱导表达重组荣昌猪IL-10蛋白。SDS-PAGE分析表明，在相对分子质量约为38kD（融合蛋白）处有明显的蛋白质表达条带，而未经诱导的PET-32a（+）-IL10在38 kD处无条带产生，光密度扫描结果显示，诱导四小时后，表达蛋白条带约占菌体总蛋白的48.5％。免疫印迹试验证实重组蛋白可以被组氨酸特异性单抗所识别，表明重组蛋白以带有组氨酸标签的融合蛋白形式表达。最后洗涤表达的IL—10融合蛋白包涵体并用MTT法检测其生物学活性。通过t检验分析表明所获得的重组猪IL-10具有较高的促猪外周血淋巴母细胞增殖反应活性，具有较强的生物学活性。本试验首次克隆出地方猪种—荣昌猪、内江猪IL-10基因，并通过对基因序列改造后经原核表达出荣昌猪IL-10融合蛋白，这为进一步研究地方猪种IL-10在体内外的作用，并为研究其生理活性及在疾病和疫苗免疫中的作用提供了条件，同时对地方猪种IL-10的深入研究，可以为地方猪种作为免疫移植的供体提供参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 IL-10的产生及分子生物学特点
• 2 IL-10受体
• 3 IL-10的生物学作用
• 3.1 免疫抑制作用
• 3.2 免疫促进作用
• 3.3 IL-10与其它细胞因子相互作用
• 4 IL-10的作用机理
• 5 IL-10的相关临床研究
• 5.1 IL-10在人医上的应用进展
• 5.1.1 IL-10与炎症
• 5.1.2 IL-10与肿瘤
• 5.1.3 IL-10与器官移植
• 5.2 IL-10在兽医生产上的应用进展
• 6 小结
• 第一章 荣昌猪、内江猪IL-10基因的克隆与序列分析
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 溶液配制
• 1.4.1 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
• 1.4.3 质粒提取（Triton法）所用溶液
• 1.4.4 细胞培养用液
• 1.4.5 RNA提取试剂配制
• 1.4.6 克隆试剂的配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 荣昌猪、内江猪外周血淋巴细胞的分离、培养及白细胞介素10的诱生
• 2.2 荣昌猪、内江猪外周血淋巴细胞总RNA的提取
• 2.3 荣昌猪、内江猪白细胞介素10基因的RT-PCR扩增
• 2.3.1 引物的设计与合成
• 2.3.2 RT-PCR
• 2.3.3 电泳检测
• 2.4 白细胞介素-10基因的克隆及鉴定
• 2.4.1 感受态大肠杆菌DH5a的制备
• 2.4.2 目的DNA片段的回收
• 2.4.3 连接转化
• 2.4.4 PIL-10质粒鉴定
• 2.4.5 序列测定
• 2.5 荣昌猪、内江猪白介素10基因生物信息学分析
• 2.5.1 PIL-10基因多重序列比较分析
• 2.5.2 PIL-10核苷酸序列同源性比较与分析
• 2.5.3 PIL-10基因的核苷酸序列的翻译
• 3 结果
• 3.1 荣昌猪、内江猪IL-10基因的RT-PCR扩增
• 3.2 重组质粒的PCR和酶切鉴定
• 3.3 重组质粒的测序鉴定
• 3.4 荣昌猪、内江猪白细胞介素10基因生物信息学分析
• 3.4.1 PIL-10基因多重序列比较分析结果
• 3.4.2 不同物种间IL-10基因同源性分析
• 3.4.3 荣昌猪、内江猪IL-10编码氨基酸序列比较
• 4 讨论
• 第二章 荣昌猪IL-10基因的原核表达研究
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验所用溶液及其配制
• 1.3.1 SDS-PAGE溶液的配制
• 1.3.2 包涵体提取与洗涤所用溶液
• 2 方法
• 2.1 PET-32a（+）-PIL-10表达载体的构建
• 2.1.1 亚克隆成熟蛋白基因引物设计
• 2.1.2 质粒的提取:
• 2.1.3 亚克隆成熟蛋白荣昌猪IL-10基因
• 2.1.4 含有荣昌猪IL-10成熟蛋白基因原核表达载体的构建
• 2.2 含有荣昌猪IL-10成熟蛋白基因的表达载体PET-32a（+）-PIL-10转化表达菌BL21（DE3）
• 2.3 PET-32a（+）-PIL-10鉴定
• 2.4 重组PET-32a（+）-PIL-10的表达
• 2.4.1 阳性克隆菌的诱导表达
• 2.4.2 SDS-PAGE电泳
• 2.4.3 PET-32a（+）-PIL-10表达鉴定
• 2.4.4 融合蛋白表达产物免疫印迹分析（Western blotting）
• 2.5 PET-32a（+）-PIL-10重组表达产物生物学活性的测定
• 2.5.1 包涵体蛋白的提取
• 2.5.2 PET-32a（+）-PIL-10蛋白含量的测定
• 2.5.3 重组表达产物生物学活性测定
• 3 结果
• 3.1 重组表达质粒PET-32a（+）-PIL-10的构建与鉴定
• 3.2 重组表达质粒的诱导表达
• 3.3 重组菌的转录检测结果
• 3.4 目的蛋白的表达量分析
• 3.5 融合蛋白表达产物Western Blotting检测
• 3.6 重组猪IL-10的生物学活性检测结果
• 3.6.1 蛋白浓度的测定
• 3.6.2 重组猪IL-10的生物学活性检测
• 4 讨论
• 4.1 关于信号肽和原核表达
• 4.2 关于SDS-PAGE电泳
• 4.3 关于包涵体
• 4.4 关于PIL-10蛋白生物活性的检测
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 参考文献
• 附录