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活性真皮替代物的制备与移植的实验研究

2020-11-29阅读(909)

活性真皮替代物的制备与移植的实验研究

论文摘要

目的:制备壳聚糖-胶原-激光微孔猪脱细胞复合真皮基质（Chitosan-Chollagen Laser Micropore Porcine acellular composite dermalmatrix,CCLMPADM）,并将成纤维细胞（Fibroblast,Fb）引入其中,构建含活性细胞成分的新型真皮替代物,用于全层皮肤缺损的修复研究,为进一步提高移植物性能打下基础。方法:1.按不同比例将壳聚糖（1mg/ml）、鼠尾胶原（3g/L）进行混合,并通过冷冻与干热两种方法制备壳聚糖-胶原膜（Chitosan-Collagenmembrane,CCM）,对CCM的物理性能以及生物相容性进行研究,来确定合适的CCM制备方法。2.体外进一步完善皮肤种子细胞库,对Fb培养方法与Ca2+对角质形成细胞（HKC）的调控作用进行研究,并应用鼠尾胶原构建全层组织工程皮肤,为进一步的研究工作打下基础。3.体外构建CCLMPADM,并将Fb引入其中,构建活性CCLMPADM。36只SD大鼠作全层皮肤缺损模型,随机分为3组,每组12只:①微孔猪脱细胞真皮基质（Porcine acellular dermal matrix,PADM）组（对照Ⅰ组）:自体刃厚皮+微孔PADM;②CCLMPADM组（对照Ⅱ组）:自体刃厚皮+CCLMPADM;③活性CCLMPADM组（实验组）:自体刃厚皮+活性CCLMPADM。进行全层皮肤缺损的修复,并对移植物成活情况、组织学进行观察。结果:1.干热法制备支架为透明光滑膜片,机械强度较高。冻干法制得支架为乳白色半透明膜片,吸水率、保水率较高。相同干燥方法时,当壳聚糖与胶原比例为8/2时,形成膜片机械强度达最大值。随胶原含量的增加,保水率与吸水率逐渐增大。CCM相容性显示,冻干法与干热法成膜,人角质形成细胞（Human Keratinocyte,HKC）的增殖率无显著性差异;但冻干法成膜的Fb增殖率高于干热法。相同制备方法,随胶原含量的增加,Fb与HKC的增殖率显著增高。包埋实验显示CCM组织相容性良好,随胶原含量增加,材料降解速度加快。2.成功建立胎儿HKC库与胎儿Fb库;改进的Fb培养方法具有培养周期短,细胞损伤小等特点;不同浓度的Ca2+对HKC的增殖与分化有不同作用;以鼠尾胶原作为载体,采用液气平面培养,可成功构建全层组织工程皮肤替代物。3.成功构建活性CCLMPADM,用于全层皮肤缺损修复,显示愈合情况明显优于PADM组与CCLMPADM组。结论:1.壳聚糖胶原比例为5/5或3/7时,是较理想的构建组织工程材料的构成比;冷冻干燥法更适于制作真皮替代材料。2.改进组织块法是较理想的Fb培养方法;Ca2+对HKC增殖与分化具有重要作用;采用鼠尾胶原、三维培养及液气面培养技术,可以构建全层皮肤模型。3.壳聚糖、胶原的引入,使Fb更容易的引入激光微孔PADM。活性CCLMPADM是较理想的真皮修复材料。

论文目录

  • 英文缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一部分 CCM构建及其相容性的实验研究
  • 实验一 CCM成膜性及其物理性质的研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂及仪器
  • 2.鼠尾胶原的制备
  • 3.壳聚糖溶液配制方法
  • 4.CCM的制备方法
  • 5.大体观察
  • 6.物理特性的检测
  • 7.组织学检查
  • 8.统计学处理
  • 结果
  • 1.大体观察结果
  • 2.各组CCM机械强度比较
  • 3.各组CCM保水率比较
  • 4.各组CCM吸水率比较
  • 5.HE染色结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录1:实验照片
  • 实验二 CCM生物相容性的研究
  • 一 CCM细胞相容性的研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂
  • 2.主要仪器与耗材
  • 3.人皮肤细胞的复苏与传代
  • 4.CCM的制备
  • 5.细胞接种
  • 6.组织学观察
  • 7.细胞增值率的检测
  • 8.Fb功能检测
  • 9.统计学处理
  • 结果
  • 1.大体观察
  • 2.HE染色结果
  • 3.不同制备方法对Fb增殖率的影响
  • 4.不同制备方法对HKC的影响
  • 5.不同制备方法对Fb功能的影响
  • 二 CCM组织相容性研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂与仪器
  • 2.CCM的制备
  • 3.动物模型及分组
  • 4.取材及观察指标
  • 结果
  • 1.大体观察结果
  • 2.组织学观察
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录2:实验照片
  • 小结
  • 第二部分 种子细胞相关研究
  • 实验一 胎儿皮肤异体细胞库的建立
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂与仪器
  • 2.胎儿HKC库的建立
  • 3.胎儿Fb库的建立
  • 4.细胞形态学观察
  • 结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录3:实验照片
  • 实验二 不同培养方法培养Fb的研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂与仪器
  • 2.取材
  • 3.Fb培养方法
  • 4.Fb形态学观察
  • 5.各组Fb增值率检测
  • 6.统计学处理
  • 结果
  • 1.光镜检查结果
  • 2.MTT结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录4:实验照片
  • 2+对HKC增殖与分化调控作用研究'>实验三 Ca2+对HKC增殖与分化调控作用研究
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.HKC培养
  • 2+对HKC体外生长的影响'>3.Ca2+对HKC体外生长的影响
  • 4.细胞组织化学
  • 5.统计学分析
  • 结果
  • 1.形态学指标
  • 2.MTT结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录5:实验照片
  • 实验四 鼠尾胶原构建全层皮肤的实验研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂与仪器
  • 2.鼠尾胶原的提取
  • 3.Fb与HKC培养
  • 4.全层皮肤的构建
  • 5.HE染色方法
  • 结果
  • 1 大体观察结果
  • 2.光镜观察结果
  • 3.HE染色结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录6:实验照片
  • 小结
  • 第三部分 活性CCLMPADM的构建及应用
  • 实验一 活性CCLMPADM的构建
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂
  • 2.主要仪器
  • 3.激光微孔真皮的制备
  • 4.CCLMPADM的制备
  • 5.大鼠皮肤Fb培养
  • 6.活性CCLMPADM的构建
  • 结果
  • 1.CCLMPADM性状
  • 2.活性CCLMPADM上培养Fb的观察
  • 实验二 活性CCLMPADM修复全层皮肤缺损的实验研究
  • 材料与方法
  • 1.主要试剂
  • 2.主要仪器
  • 3.活性CCLMPADM制备
  • 4.动物模型及分组
  • 5.观察指标
  • 6.统计学处理
  • 结果
  • 1.大体观察结果
  • 2.HE染色结果
  • 3.免疫组化染色结果
  • 4.毛细血管密度
  • 讨论
  • 参考文献
  • 附录7:实验照片
  • 小结
  • 全文结论
  • 文献综述
  • 参考文献
  • 学习期间发表论文及待发表论文情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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