内蒙古绒山羊精液冷冻保存的研究

论文摘要

内蒙古绒山羊产于内蒙古鄂尔多斯市、阿拉善盟和巴彦淖尔盟,具有繁殖力高,适应性强,产绒量多,绒毛细等特点。用冷冻精液通过人工授精技术可以加速优良种群扩繁,加快绒山羊良种化进程。但是由于山羊精子的生理特点,其冷冻效果自然很低,目前仍未形成一种有效的冷冻保存技术程序。为了进一步改善绒山羊冷冻精液品质,本研究在改进绒山羊冷冻方法与优化冷冻稀释液方法进行了研究,以精子活率、质膜完整性、线粒体活性、顶体完整率和DNA完整性等为检测指标,利用荧光显微镜结合流式细胞术以及一些常规检测手段对精子品质进行了客观有效的评价,目的是研究出适合内蒙古绒山羊精液冷冻保存的稀释液配方和冷冻程序。为绒山羊精液冷冻的实际应用奠定基础。本论文主要分五个部分对精子冷冻技术进行了研究,结果如下:1.对精液冷冻程序进行了系统优化研究。结果表明:（1）稀释比例1:3（v/v）,去除精浆,一步法稀释,采用缓慢降温法（降温前在室温下静置10 min）,降温3 h;（2）平衡后放在距液氮面4㎝处薰蒸,时间为10 min;（3）用较高温度解冻,55℃水浴6 s;解冻后精液放入37℃水浴锅内孵育10 min,精子复苏后进行指标的评价冷冻效果最优。2.通过逐步法对国内外9种较好的稀释液进行筛选,筛选出最好的基础液为D组（Tris 3.07g、柠檬酸1.64g、葡萄糖0.5g、果糖0.66g,卵黄5%）,平均活率达41.21%,顶体完整率和质膜完整性平均分别为75%、62.27%,效果显著优于其他组（p<0.05）。3.不同添加成分对精子冷冻效果的研究。筛选出三类物质的最优成分和添加量:（1）糖类在稀释液中属于非渗透性冷冻保护剂,在稀释液中具有维持渗透压和给精子供能等主要作用,在蔗糖、海藻糖和葡聚糖3种糖的添加比较研究中确定海藻糖能有效的提高精子解冻后的质量,添加后活力平均达到0.44,优于其他组（p<0.05）,最佳添加终浓度为62.5mM;（2）研究4种渗透性抗冻剂对精液冷冻的效果。结果表明:甘油对精子的冷冻保护效果最佳,平均活率0.42,优于其他组（p<0.05）,添加浓度5%（v/v）;（3）稀释液中添加抗氧化剂的效果研究。抗氧化剂具有清除精子代谢产生的活性氧簇ROS和减弱不饱和脂防酸的氧化等作用,关于L-谷氨酸、β-巯基乙胺、亚牛磺酸的报道较少,本试验在D组稀释液的基础上,研究3种不同浓度的抗氧化剂对山羊精子冷冻效果的影响。结果表明,3种抗氧化剂对冷冻后精子活率都显著提高（p<0.05）,但L-谷氨酸对山羊精子的冷冻保护效果比β-巯基乙胺和亚牛磺酸明显（p<0.05）,添加L-谷氨酸后活率平均达到0.48,最佳添加浓度为5 mM。4.本实验用AO（吖啶橙）染色方法研究冷冻前后精子的DNA完整性,分析冷冻是否对精子DNA造成进一步的损害,海藻糖在山羊精子冷冻-解冻过程中可以改善精子的质量,对精子DNA的完整性的保护作用优于其他组（p<0.05）;细管冻精在高倍稀释与低倍稀释相比,可明显增加解冻后精子DNA的损伤程度,通过精子细胞的TUNEL凋亡测定,冷冻前后对精子DNA的损伤程度不明显或不显著（p>0.05）。但添加保护剂后可加剧DNA的损伤程度（p<0.05）。5.为了最大限度地利用优良种山羊的遗传资源,进一步研究了附睾精子的冷冻效果,通过对山羊附睾精子的冷冻效果研究,结果表明:山羊附睾精子能够成功地冷冻保存,冷冻效果优于射出精子的冷冻效果,冷冻后活率平均达0.55。综上所述,本实验通过筛选内蒙古白绒山羊精液冷冻-解冻程序和稀释液配方的优化组合,在5%的甘油下添加海藻糖（62.5 mM）和L-谷氨酸（5 mM）,取得了较好的冷冻效果,解冻后精子活率平均达0.48。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 精液冷冻保存技术的研究进展
• 1.1.1 精液冷冻保存的意义
• 1.1.2 家畜冷冻精液保存研究的现状
• 1.1.3 家畜精液冷冻技术研究现状
• 1.1.4 山羊精液冷冻保存技术的研究进展
• 1.2 精子的发生
• 1.2.1 精子细胞的特殊性
• 1.2.2 附睾精子细胞的特殊性
• 1.2.3 精子发生调节
• 1.2.4 精子发生过程中精子的形态变化
• 1.3 精液冷冻保存机理
• 1.3.1 冻晶形成的机理
• 1.3.2 冷冻对细胞的损伤
• 1.3.3 精液冷冻过程中的变化
• 1.3.4 冷冻对精子功能的影响
• 1.3.5 玻璃化冻结的保护作用
• 1.4 精液冷冻保存的影响因素
• 1.4.1 稀释液
• 1.4.2 精清
• 1.4.3 冷冻保护剂
• 1.4.4 温度变化
• 1.4.5 精液冷冻方法
• 1.4.6 冷冻保存的程序
• 1.4.7 解冻方法
• 1.5 山羊精液质量评定方法
• 1.5.1 精液品质评定的常规指标
• 1.5.2 精子质量评定的新方法
• 1.5.3 分子检测指标
• 1.6 冷冻精液的优点
• 1.6.2 山羊精液冷冻技术存在的主要问题与展望
• 1.7 研究的目的和意义
• 2 研究一 内蒙古绒山羊细管精液冷冻基础液筛选与冷冻程序的优化研究
• 2.1 山羊细管精液冷冻基础液筛选与温度曲线的研究
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.3 冷冻精液的冷冻温度曲线
• 2.1.4 结论与讨论
• 2.2 稀释方法与精清去留对山羊精液冷冻效果研究
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.3 讨论与结论
• 3 研究二 不同添加成分对山羊精液冷冻效果的研究
• 3.1 海藻糖、蔗糖和葡聚糖对山羊精子冷冻保存的影响
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 精液采集
• 3.1.1.2 稀释液配制
• 3.1.1.3 精液的稀释与平衡
• 3.1.1.4 细管冻精的制备
• 3.1.1.5 冷冻-解冻后细管冻精的质量评定
• 3.1.1.6 统计分析
• 3.1.2 结果与分析
• 3.1.3 结论与讨论
• 3.2 抗冷冻保护剂对山羊精子冷冻保存技术的研究
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.3 讨论
• 3.3 不同抗氧化剂对山羊冷冻保存技术的影响
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.2 结果与分析
• 3.3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 研究三 冷冻对山羊精子遗传物质的影响
• 4.1 冷冻对山羊精子染色质结构的影响
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.2 结果与分析
• 4.1.3 结论与讨论
• 4.2 冷冻对山羊精子细胞凋亡的影响
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.2 结果与分析
• 4.2.3 讨论
• 5 研究四 绒山羊附睾精子冷冻保存技术的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 6 结论及创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介