论文题目: 诱导型激活拟南芥突变体库的构建以及AtCRK3生化、表达分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 发育生物学
作者: 杜伟
导师: 吕应堂
关键词: 化学诱导激活标签,盐胁迫,相关蛋白激酶,原位杂交,拟南芥
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本课题主要是由两个部分组成。一个部分是通过化学诱导激活标签构建拟南芥突变体库,并从中筛选到两个盐信号突变体;另外一个部分是对拟南芥中的AtCRK3蛋白进行了生化、生理方面的研究。 在植物功能基因组研究中,突变体在研究基因功能方面起到十分重要的作用。由于拟南芥具有较小的基因组、高效的转化方法以及已完全测序的Col-0型基因组序列,目前已是一种很重要的模式植物,因而在拟南芥突变体库构建中建立出一种有效的基因标签系统就显得十分重要。在化学诱导型启动子/增强子标签系统(PER16)中,目标基因的转录是受到雌激素严格调控的:在加入了雌激素的条件下,目标基因可达到的转录水平是35S启动子的8倍,在没有雌激素诱导的条件下,目标基因的转录则不能被检测到,另外所施加的雌激素对转基因拟南芥没有明显的毒性。因为PER16系统具有很多其它系统不具有的优点,所以将PER16载体随机插入到拟南芥基因组中构建成突变体库是一种十分有效的研究基因功能的方法,可以让我们在研究中发现到一些在其它组成型增强子调控下而导致生长收到严重影响甚至致死型的突变体。此部分的主要实验结果如下: 在拟南芥转化实验中,采用的是Col-0型拟南芥,农杆菌菌株为GV3101,通过农杆菌侵染方法(floral dip),将基于雌激素受体的化学诱导激活标签系统PER16转入拟南芥中。通过优化拟南芥的栽培、转化以及转基因植株的筛选方法,建立了一个稳定的技术平台,转化效率一般为1～2%。通过这个转化系统最终得到了22,000株含有PER16的插入株系。通过PCR鉴定了其中40株转基因株系的T-DNA的插入,发现其中有一株没有T-DNA插入,插入比例为97.5%。通过Kan抗性筛选,统计了其中1000株转化株系的T2代种子的Kan抗性分离比,发现平均每个转基因株系中含有1.5个T-DNA标签。这表明在此突变体库中拟南芥基因组上共有33,000位点被插入标记。另外和其他几位同学从本突变体库T2代种子中筛选出几个形态方面突变体,其中一株属于雌激素诱导表达型突变体,而此基因的插入失活突变体则没有明显的表型。以上结果表明已成功的构建了诱导型激活拟南芥突变体库。 对来源于本实验室构建的诱导型激活拟南芥突变体库的200,000粒T2代种子进行了盐信号突变体的筛选。盐耐受突变体的筛选方法是挑取能够在含有250mM NaCl固体培养基上萌发的拟南芥突变体,最后我们得到1株突变体,称之为high salt tolerant l
论文目录:
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英文摘要
缩略词表
第一章 前言
一.拟南芥突变体库的研究概况
1.拟南芥的普通生物学特性
2.拟南芥的遗传学特性
3.拟南芥突变体库的类型和特点
二.植物的耐盐机理研究
1.调节渗透压
2.清除活性氧
3.平衡细胞内离子浓度
4.盐胁迫信号传导
三.植物钙信号转导蛋白激酶家族研究进展
1.植物钙信号
2.植物中蛋白激酶
3.CDPK超家族蛋白激酶
四.本项研究的目的和意义
第二章 诱导型拟南芥突变体库的构建和鉴定
一.前言
二.材料和方法
1.拟南芥的栽培与转化
2.拟南芥转化植株的微量DNA提取
3.转基因拟南芥植株的PCR检测
4.转基因拟南芥植株T2代的Kan鉴定
5.Tail-PCR产物的纯化及测序
6.序列分析
三.实验结果
1.野生型拟南芥的转化
2.拟南芥转化植株的PCR鉴定
3.拟南芥转化植株的Kan鉴定
4.筛选到的几个突变体的表型分析
四.讨论
1.拟南芥T-DNA突变体库的大小
2.本研究突变体库的利用
第三章 筛选盐信号拟南芥突变体
一.前言
二.材料与方法
1.高盐耐受突变体的筛选
2.胁迫条件对野生型和突变体种子的萌发率的影响
3.胁迫条件对野生型和突变体幼苗的影响
4.鉴定突变体表型是否同插入位点共分离
三.结果
1.高盐耐受突变体的筛选
2.NaCl对突变体hst1种子萌发的影响
3.其它胁迫条件对hst1突变体种子萌发率的影响
4.NaCl对突变体hst1幼苗生长的影响
5.hst1突变表型同T-DNA插入共分离的鉴定
6.盐敏感突变体的鉴定
7.其它胁迫条件对hss1突变体种子萌发率的影响
8.盐敏感突变体的表型分析
9.hss1突变表型同T-DNA插入共分离的鉴定
四.讨论
1.耐盐突变体的筛选
2.盐敏感突变体的筛选
第四章 拟南芥AtCRK3的激酶活性分析
一.前言
二.方法与步骤
1.实验材料与质粒图谱
2.文库的筛选
3.AtCRK3昆虫细胞表达载体构建
4.重组杆状质粒DNA转化St9昆虫细胞
5.收获重组病毒和感染的昆虫细胞
6.重组蛋白质的纯化
7.Western blotting检查
8.从工程菌中纯化重组钙调素
9.AtCRK3蛋白激酶酶活分析
10.AtCRK3蛋白激酶酶活曲线分析
11.不同的反应条件对AtCRK3底物磷酸化的影响
12.毛细管电泳分析磷酸化氨基酸
三.实验结果
1.AtCRK3基因序列的分析
2.AtCRK3同其它蛋白激酶蛋白质序列的比较分析
3.昆虫细胞表达载体构建
4.纯化昆虫细胞表达的AtCRK3蛋白
5.AtCRK3激酶酶活分析
6.AtCRK3的钙调素结合区的分析
7.AtCRK3磷酸化氨基酸分析
8.不同的反应条件下AtCRK3的酶活分析
四.讨论
1.蛋白质纯化
2.CRKs蛋白质序列分析
3.AtCRK3激酶酶活分析
第五章 拟南芥AtCRK3的表达分析
一.前言
二.材料与方法
1.实验材料与质粒图谱
2.Northern杂交
3.RNA原位杂交方法
4.通过GUS染色分析AtCRK3在拟南芥组织中的分布
5.分析AtCRK3：：GFP融合蛋白在细胞内定位
6.通过转基因拟南芥研究AtCRK3的功能
三.实验结果
1.不同组织中AtCRK3表达的Northern分析
2.通过GUS染色分析AtCRK3的分布
3.胁迫条件对AtCRK3基因表达的影响
4.通过RNA原位杂交研究AtCRK3的分布
5.AtCRK3蛋白在洋葱表皮细胞内的定位
6.AtCRK3超量表达和knock out植株表型分析
四.讨论
1.AtCRK3基因在不同组织中的差异性表达
2.AtCRK3在细胞内定位
3.AtCRK3在ABA和寒冷信号传导中的作用
4.AtCRK3在植物体内的作用
参考文献
附录部分
发表及投稿文章
致谢
发布时间: 2006-03-27
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