人尿酸氧化酶1-2号外显子的替换及重组蛋白的表达

论文摘要

尿酸氧化酶（Urate Oxidase, Uricase EC1.7.3.3）也称尿酸酶，是一种以氧作为受体的氧化酶，广泛存在于哺乳动物肝细胞的过氧化物酶体中，能催化尿酸氧化为更易于排泄的代泄物即尿囊素。在许多物种体内均发现有尿酸氧化酶，但在鸟类及一些高等灵长类动物（如猿和人类）的体内却缺乏具有功能的尿酸酶，而是以尿酸作为嘌呤代谢的终产物排出体外。如果体内产生过多尿酸来不及排泄或者尿酸排泄机制退化使体内尿酸过多，就会影响人体细胞的正常功能，长期体内尿酸浓度过高将会引发痛风。目前使用的降低体内尿酸水平的药物主要分为三类：促进尿酸排泄药、抑制尿酸合成药和尿酸氧化酶。有研究表明，尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其它药物。由于人体内的尿酸氧化酶不具有活性，目前临床上用的尿酸氧化酶主要来自黄曲霉菌（Aspergillus flavus），因其是外源蛋白，具有免疫原性，临床应用受到极大限制。已有研究通过PEG化修饰尿酸氧化酶以降低其免疫原性，但经PEG修饰后酶的催化活性下降幅度较大。人类尿酸酶基因因突变而成为假基因，如果能使之“复活”，必然能够在很大程度上降低该酶的免疫原性。为进一步探究人尿酸氧化酶失活的原因，也为寻找与人类同源性更接近的哺乳动物来源的尿酸氧化酶，本实验采用生物信息学的方法，根据NCBI上已公布的人和猪尿酸酶基因序列设计引物，从猪肝脏组织中提取总RNA，通过RT-PCR方法获得猪尿酸酶基因，并定向插入到大肠杆菌原核表达载体pET-22b（+）中，构建猪尿酸酶基因工程菌pET-22b（+）/pUOX，经IPTG诱导在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）表达菌株中实现高效表达，通过12%SDS-PAGE电泳检测表达情况，用紫外吸收法测定猪尿酸酶基因工程菌的蛋白酶活性为1.962U/mL。测序后与预期序列一致。人尿酸酶基因是由本实验室从人肝脏组织中提取的，保存在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中。经SDS-PAGE蛋白电泳检测该蛋白有表达，但无蛋白酶活性。人类尿酸酶酶的外显子2和外显子5中都存在着编码精氨酸的密码子CGA突变成为终止密码子TGA，且有研究表明，2号外显子的突变是进化的开始。所以，本实验将具有活性的猪源尿酸氧化酶基因与无活性的人源尿酸氧化酶基因对应的1-2号外显子进行替换，构建出人猪尿酸酶重组基因pEU-H1-2，并在BL21（DE3）菌株中进行表达。通过IPTG诱导后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测，在约34kDa处有一条明显的蛋白条带，这与预期的303个氨基酸相符。测定该重组蛋白的酶活力达到0.833U/mL。经测序后与预期序列一致，但与猪尿酸氧化酶活性相比有所降低，经BlastN在线序列比对后发现人猪尿酸酶重组工程菌与猪尿酸酶基因存在6处有义突变。人猪尿酸酶重组工程菌的成功构建且具有酶活性，证明了人尿酸氧化酶基因1-2号外显子中存在的密码子有义突变并不是引起人尿酸酶失活的主要原因，这对人类尿酸氧化酶基因的失活的进一步研究打下了良好的实验基础，也为后续实验提供有益的帮助。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 1.文献综述
• 1.1 假基因的发现
• 1.2 、假基因的命名方式与分类标准
• 1.2.1 假基因的命名方法
• 1.2.2 假基因的分类标准
• 1.3 假基因的确定
• 1.3.1 假基因的特性和分布特点
• 1.3.1.1 假基因的特性
• 1.3.1.2 假基因的分布特点
• 1.4 假基因的生物功能与医学应用
• 1.4.1 DNA 作用机理
• 1.4.2 RNA 作用机理
• 1.4.3 假基因调控在医学上的应用
• 1.5 假基因与进化
• 1.5.1 保持真核生物基因组的流动性
• 1.5.2 物种之间亲缘关系的确定
• 1.5.3 “沉默”基因在进化中的作用
• 1.6 假基因的“复活”
• 1.7 展望
• 2 引言
• 3 材料、试剂与仪器
• 3.1 质粒和菌株
• 3.2 培养基
• 3.3 工具酶
• 3.4 DNA 和蛋白 Marker
• 3.5 试剂
• 3.6 主要溶液
• 3.7 主要仪器
• 4 材料与方法
• 4.1 猪肝脏总 RNA 的提取
• 4.1.1 实验准备
• 4.1.2 猪肝脏组织 RNA 的提取
• 4.2 RT-PCR 法获得猪尿酸氧化酶基因
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 RT-PCR 获得猪尿酸酶基因
• 4.3 猪尿酸氧化酶表达载体的构建
• 4.3.1 原核表达载体 pET-22b（+）的质粒提取
• 4.3.2 猪尿酸酶重组质粒的构建
• 4.4 pET-22b/pUOX 重组菌的诱导表达及酶活测定
• 4.4.1 pET-22b/pUOX 的蛋白表达
• 4.4.2 pET-22b/pUOX 酶活的测定
• 4.5 人尿酸酶基因的获取
• 4.5.1 人尿酸酶菌株的活化
• 4.5.2 人尿酸酶工程菌质粒的提取
• 4.5.3 人尿酸酶基因的扩增
• 4.6 人猪尿酸酶重组基因的克隆及表达
• 4.6.1 重叠延伸引物的设计
• 4.6.2 人、猪尿酸酶基因外显子的克隆
• 4.6.3 人猪尿酸酶重组基因的克隆
• 4.6.4 人猪尿酸酶重组质粒的构建
• 4.6.4.1 表达载体 pET-22b（+）的质粒提取
• 4.6.4.2 重组基因及质粒的双酶切
• 4.7 pEU-H1-2 的表达及优化
• 4.7.1 pEU-H1-2 表达量与菌密度的关系
• 4.7.2 pEU-H1-2 表达量与诱导时间的关系
• 4.7.3 pEU-H1-2 表达量与 IPTG 浓度关系的测定
• 4.8 pEU-H1-2 酶活的测定
• 5. 结果与分析
• 5.1 RT-PCR 法获得猪尿酸酶基因
• 5.2 猪尿酸酶 pET-22b/pUOX 的表达及酶活测定
• 5.2.1 猪尿酸酶 pET-22b/pUOX 的表达
• 5.2.2 猪尿酸酶 pET-22b/pUOX 的酶活测定
• 5.3 人尿酸酶基因的提取及扩增
• 5.4 人猪重组基因的克隆
• 5.4.1 人、猪尿酸酶外显子的克隆
• 5.4.2 人猪尿酸氧化酶重组基因的克隆
• 5.5 重组表达质粒的构建
• 5.6 重组质粒的表达及酶活测定
• 5.6.1 宿主菌 BL21（DE3）生长曲线的测定
• 5.6.2 重组质粒 pEU-H1-2 的诱导表达
• 5.6.3 pEU-H1-2 表达量与发酵液浓度的关系
• 5.6.4 pEU-H1-2 表达量与时间的关系
• 5.6.5 pEU-H1-2 表达量与 IPTG 浓度关系
• 5.7 人猪尿酸酶重组蛋白酶活性
• 6 结论
• 6.1 猪尿酸酶基因的提取、克隆及表达
• 6.2 人尿酸酶的获取、克隆及表达
• 6.3 人 1-2 号外显子的替换、克隆及表达
• 7 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 附件