木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

论文题目: 木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 王海宽

导师: 路福平

关键词: 黄孢原毛平革菌,木质素过氧化物酶,锰过氧化物酶,甲醇毕赤酵母,异源表达

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,Lip)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase,Mnp)是由黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分泌的单血红素糖蛋白。利用黄孢原毛平革菌生产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶受到许多因素的限制。例如:只有在限氮或其它不均衡的培养基中才能分泌并且酶活较低,同时其菌丝在发酵罐中易受高剪切力的损伤。本论文重点研究木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达,并对工程菌发酵条件和培养基进行了研究。主要研究内容和结果如下: [1]包含信号肽的lipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达 以黄孢原毛平革菌RNA为模板,通过RT-PCR获得包含信号肽的lipH8基因片段,克隆进入pMETA载体得到在甲醇酵母表达的pMETA-lipH8重组质粒,将其线性化后用电穿孔法导入pichia methabolica pMAD16,筛选得到1株表达水平较高的酵母工程菌株,酶活可达932U/L。 [2]去自身信号肽的lipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达 克隆去自身信号肽的lipH8基因,克隆进入pMETαA载体得到在甲醇酵母表达的pMETαA-lipH8—ss重组质粒,将其线性化后用电穿孔法导入pichia methabolica pMAD16,筛选出表达水平高的酵母工程菌株,酶活可达1933U/L。 [3]pMETαA-lip08表达木质素过氧化物酶发酵条件的优化 确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L,pH为3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。 [4]pMETαA-lip08表达木质素过氧化物酶发酵培养基的研究 进行了麦芽汁培养条件的研究,用1∶6麦芽汁培养工程菌,然后用高温浸提液诱导产酶较好。进一步通过发酵罐培养来研究产酶情况,结果表明产酶稳定。而用无机盐培养酶活性较低且不稳定。 [5]去信号肽的mnp2基因在甲醇毕赤酵母中的表达 以提取自Phanerochaete chrysosporium的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增得到了去除自身信号肽的mnp2基因;成功的将mnp2基因与含酿酒酵母α-因子信号肽的载体pMETαA相连,构建了重组表达载体pMETαA-mnp2;首次在Pichia methanolica pMAD16中实现了锰过氧化物酶基因的表达。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 木质素的生物降解

1.1.1 木质素的生物降解研究现状

1.1.2 木质素的生物降解研究的目的及意义

1.1.3 木质素降解体系

1.2 木质素过氧化物酶

1.2.1 木质素过氧化物酶同功酶的物理及酶学特性

1.2.2 木质素过氧化物酶发酵条件的研究

1.2.3 木质素过氧化物酶的降解机制

1.3 Lip基因的研究

1.3.1 Lip基因的结构

1.3.2 Lip基因的表达调控

1.4 木质素过氧化物酶的异源表达

1.5 锰过氧化物酶

1.5.1 锰过氧化物酶的基本特性与作用机理

1.5.2 锰过氧化物酶的同源表达和异源表达

1.6 酵母表达系统

1.6.1 酿酒酵母表达系统

1.6.2 毕赤酵母表达系统

1.6.3 影响外源基因在酵母中表达的因素

1.7 本论文的立题依据及研究内容

1.7.1 立题依据

1.7.2 主要研究内容

1.8 论文撰写说明

第二章 包含信号肽的LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 菌株与质粒

2.2.2 引物

2.2.3 主要试剂

2.2.4 培养基和溶液

2.2.5 主要仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 木质素过氧化物酶基因的克隆

2.3.2 克隆载体pUC19-lipH8的构建及转化大肠杆菌

2.3.3 表达载体pMETA-lipH8的构建及转化甲醇毕赤酵母

2.3.4 转化子的鉴定

2.3.5 工程菌菌种特性的研究及表达优化

2.4 结果与讨论

2.4.1 出发菌株菌种特性研究

2.4.2 引物的设计

2.4.3 黄孢原毛平革菌的总RNA的提取

2.4.4 RT-PCR扩增目的基因

2.4.5 重组质粒pUC19-lipH8的构建及转化大肠杆菌

2.4.6 表达载体pMETA-lipH8的构建

2.4.7 表达载体pMETA-lipH8转化PichiamethanolicapMAD16

2.4.8 甲醇毕赤酵母PMAD16电转化条件的优化

2.4.9 pMETA-lipH8的酵母转化子的筛选与鉴定

2.4.10 工程菌菌株特性的研究

2.5 本章小结

第三章 去自身信号肽的LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 菌株与质粒

3.2.2 引物

3.2.3 主要试剂

3.3 实验方法

3.3.1 去信号肽木质素过氧化物酶基因lipH8的克隆

3.3.2 克隆载体pUC19-lipH8-ss的构建及转化大肠杆菌

3.3.3 表达载体pMETαA—lipH8-ss的构建

3.3.4 重组质粒pMETαA-lipH8—ss的线性化及纯化

3.3.5 电转化Pichia methanolica以及鉴定

3.3.6 转化子的诱导表达以及表达蛋白的电泳

3.4 结果与讨论

3.4.1 木质素过氧化物酶基因的克隆

3.4.2 重组质粒pUC19-lipH8-ss的构建及转化大肠杆菌

3.4.3 表达载体pMETαA-lipH8的构建

3.4.4 表达载体pMETαA-lipH8-ss转化Pichia methanolica pMAD16

3.4.5 工程菌pMETαA-LipO8菌株特性的研究

3.5 本章小结

第四章 pMETαA-lipO8表达木质素过氧化物酶发酵条件和培养基的优化

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 菌株

4.2.2 培养基

4.3 实验方法

4.3.1 菌种的活化

4.3.2 不同葡萄糖浓度对木质素过氧化物酶表达量的影响

4.3.3 表达条件的优化

4.3.4 麦芽汁的制备

4.3.5 高温浸提液的制备

4.3.6 麦芽汁摇瓶培养工艺

4.3.7 无机盐培养基培养pMETαA-lipO8的研究

4.3.8 pMETαA-lipO8工程菌发酵罐放大培养

4.4 结果与讨论

4.4.1 一步法发酵培养基葡萄糖浓度的确定

4.4.2 表达条件的优化

4.4.3 麦芽汁和麦芽高温浸提汁的制备

4.4.4 不同糖度的麦芽汁对细胞增殖的影响

4.4.5 不同糖度的麦芽汁对产酶的影响

4.4.6.不同培养基和发酵方法对产酶的影响

4.4.7 不同料水比的高温浸提液对产酶的影响

4.4.8 pMETαA-lipO8工程菌产酶曲线的绘制

4.4.9 无机盐培养基培养pMETαA-lipO8的研究

4.4.10 pMETαA-lipO8发酵罐放大培养

4.5 本章小结

第五章 去自身信号肽的mnp2基因在甲醇毕赤酵母中的表达

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 菌株与质粒

5.2.2 引物

5.2.3 主要试剂

5.3 实验方法

5.3.1 RT-PCR扩增

5.3.2 重组表达载体的构建

5.3.3 电转化甲醇毕赤酵母

5.3.4 mnp2在酵母中的诱导表达

5.3.5 锰过氧化物酶活力测定

5.4 结果与讨论

5.4.1 锰过氧化物酶基因的克隆与表达

5.5 本章小结

第六章 全文总结与展望

6.1 全文总结

6.2 本论文创新点

6.3 展望

致谢

攻读博士学位期间发表论文

附图

发布时间: 2007-01-10

参考文献

• [1].灵芝木质素降解酶系相关基因的克隆与酵母表达[D]. 周选围.上海师范大学2014
• [2].偏肿拟栓菌锰过氧化物酶cDNA基因克隆及在毕赤酵母中的表达[D]. 闫洪波.东北林业大学2009
• [3].白腐菌高效改性木质素促进秸秆酶解反应机制研究[D]. 宋丽丽.华中科技大学2013

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• [5].荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达[D]. 王海燕.中国农业科学院2006
• [6].黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）转化系统的建立及木质素酶cDNA的同源表达[D]. 李维.四川大学2000
• [7].纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D]. 黄志立.华南理工大学2001
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