野生稻基因组富集文库的构建及抗性基因筛选

论文摘要

野生稻中含有丰富的有利基因,是拓展栽培稻遗传基础的重要基因资源,但传统杂交转育种存在由于生殖隔离引起的诸多局限性,直接从野生稻中克隆有利基因也由于野生稻基因组背景知识的匿乏等因素而存在困难。本研究集成了候选抗性基因克隆技术和磁珠富集文库技术以及可转化基因组文库技术,提出了基于候选抗性基因富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略。它包括构建野生稻可转化基因组文库,利用RecA重组蛋白介导生物素标记的探针对文库进行磁珠富集,构建候选抗性基因富集文库。探针为根据抗性基因NBS-LRR类保守序列设计的简并特异性引物和特异性引物对野生稻的扩增产物。然后,对富集文库的克隆进行鉴定分析,包括点杂交和克隆末端测序分析。最后,对富集文库的克隆进行全序列测定分析和功能验证。本研究构建了东乡和小粒野生稻可转化基因组文库,库容量分别达到97.01%和98.42%,进而构建了野生稻候选抗性基因富集文库,单克隆总数10368个,对富集文库的菌落原位杂交筛选获得22个阳性克隆。阳性克隆末端测序结果表明,部分克隆含有全长新候选抗性基因,证实构建候选抗性基因富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略是可行的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 国内外研究现状
• 1.1 野生稻的分布与分类
• 1.2 野生稻有利性状的利用
• 1.3 植物抗性基因的克隆策略
• 1.3.1 图位克隆
• 1.3.2 表型克隆
• 1.3.3 转座子标签法
• 1.3.4 mRNA差异显示技术
• 1.4 大片断可转化基因组文库
• 1.4.1 Cosmid文库
• 1.4.2 YAC文库
• 1.4.3 BAC文库
• 1.4.4 构建植物基因组文库载体的选择
• 1.4.5 可转化基因组文库的发展
• 1.4.6 基因组文库与芯片技术
• 1.5 RecA蛋白富集方法的原理及应用
• 第二章 研究的目的和意义
• 第三章 实验材料
• 3.1 野生稻、菌株和载体
• 3.2 试剂与试剂盒
• 3.3 实验所用引物
• 3.3.1 特异性引物
• 3.3.2 简并特异性引物
• 第四章 实验方法
• 4.1 野生稻基因组文库的构建
• 4.1.1 野生稻基因组DNA的制备
• 4.1.2 野生稻基因组DNA酶切
• 4.1.3 pCAMBIA1301载体处理
• 4.1.4 连接测试及转化
• 4.1.5 连接及转化
• 4.1.6 文库质量及稳定性检测
• 4.1.7 野生稻液体文库的制备
• 4.2 野生稻富集文库的构建
• 4.2.1 富集探针制备及测序
• 4.2.2 富集反应及转化
• 4.2.3 富集文库的保存
• 4.3 富集文库的杂交筛选
• 4.3.1 杂交探针的制备
• 4.3.2 杂交膜的处理
• 4.3.3 杂交
• 4.3.4 显色与压片
• 4.4 阳性克隆鉴定及分析
• 4.4.1 阳性克隆酶切图谱
• 4.4.2 阳性克隆末端测序
• 4.4.3 生物信息学分析
• 第五章 结果与分析
• 5.1 野生稻基因组文库
• 5.1.1 高质量基因组DNA的制备
• 5.1.2 载体处理
• 5.1.3 连接测试
• 5.1.4 连接及转化
• 5.1.5 液体文库的制备
• 5.2 野生稻富集文库的构建
• 5.2.1 富集探针序列分析
• 5.2.2 富集后转化
• 5.2.3 富集文库的保存
• 5.3 富集文库的杂交筛选和鉴定
• 5.3.1 杂交探针质量分析
• 5.3.2 杂交膜的处理
• 5.3.3 杂交膜显色
• 5.4 阳性克隆鉴定及生物信息学分析
• 5.4.1 阳性克隆酶切图谱
• 5.4.2 阳性克隆末端测序分析
• 第六章 讨论
• 6.1 pCAMBIA1301构建基因组文库的优势
• 6.2 RecA富集策略在基因组文库中的应用
• 6.3 RecA富集策略应用及展望
• 结束语
• 致谢
• 参考文献
• 作者在学期间取得的学术成果
• 附录A 仪器设备
• 附录B 试剂配方
• 附录C 缩略词