论文摘要
前列腺癌发病率的持续增长和死亡率的增加是近年来困扰大家的一个公众问题。在欧美国家,前列腺癌是男性病死率占第二位的恶性肿瘤。近年来尽管在前列腺癌的诊断、治疗方面取得了一些进展,但像前列腺癌的病因、预防和治疗还存在很多问题,相对其他大多数肿瘤,我们对前列腺癌的了解还是远远不够。因此,寻找一种特异性较高的前列腺癌肿瘤标记物或癌基因对前列腺癌的诊断治疗有很大的意义。研究表明,肿瘤细胞凋亡的减少与肿瘤的发生、发展的密切相关。并且使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因此,诱导肿瘤细胞凋亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。Survivin定位于17q25,是一个凋亡抑制基因,属于IAP家族。它编码142氨基酸残疾16.5KD的胞浆蛋白,survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能,它抑制凋亡的作用是通过与凋亡效应分子caspase3、7直接结合实现的。Survivin主要表达在细胞周期的G2/M期,结合与有丝分裂期的微管,不仅参与细胞浆分裂,而且参与细胞有丝分裂的其它诸多方面。分析其表达谱发现,survivin在胚胎和几乎所有的肿瘤组织中表达,survivin已成为诊断和评价预后的标志物。由于它特异性的表达与促进肿瘤生长的功能,使之成为肿瘤治疗的新靶点。目的:1.建立一种新型安全有效的前列腺癌基因治疗体系;2.研究Survivin-D71A突变基因在体外对前列腺癌PC3、DU145、LNcap细胞株的凋亡作用的影响。3.研究Survivin-D71A突变基因在荷前列腺癌裸鼠体内对实体肿瘤的实验治疗作用。方法:①重组PCR法克隆Survivin-D71A全长cDNA,构建重组腺病毒穿梭载体pshuttle-Survivin-D71A,并与腺病毒骨架质粒pAdessy-1以电穿孔法在BJ5183菌中同源重组,获得重组腺病毒载体rAdeno- Survivin-D71A。将线性化的rAdeno- Survivin-D71A以脂质体法转染QBI-293A细胞,制备和纯化复制缺陷型重组腺病毒Ad- Survivin-D71A。②细胞计数、DAPI染色法、流式细胞法和Western印迹实验评估Ad- Survivin-D71A对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用。③将Ad-Survivin-D71A感染前列腺癌细胞分别接种于裸鼠背部皮下,建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型,定期观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。④将前列腺癌细胞分别接种于裸鼠背部皮下,建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型,采取瘤体直接注射的方法将表达Survivin-D71A的重组腺病毒直接导入瘤体,定期观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。结果:①构建含完整表达框的重组腺病毒穿梭载体pshuttle-CMV -Survivin-D71A。pshuttle-CMV-Survivin-D71A与pAdessy-1同源重组,获得重组腺病毒载体rAdeno-Survivin-D71A。线性化的rAdeno-Survivin-D71A在QBI-293A细胞中包装、扩增、纯化、浓缩,经TCID50法测定,获得滴度约为1×1010pfu/mL的复制缺陷型重组腺病毒Ad-Survivin-D71A。②细胞计数结果显示Ad-Survivin-D71A组肿瘤细胞生长增殖能力较对照组明显降低;DAPI染色显示,Ad-Survivin-D71A组中凋亡细胞明显增多;流式细胞法检测出明显的凋亡峰,细胞周期也有所改变,与无任何处理的对照相比,G2-M期亚群减少,S期亚群增加。Western-blot证实Survivin表达受到明显抑制。③在Ad-Survivin-D71A组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积明显减少。结论:1.Ad-Survivin-D71A可增加体外前列腺癌细胞的凋亡。2. Ad-Survivin-D71A可明显抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的形成和生长。Survivin有望成为前列腺癌基因治疗的一个潜在候选靶点,Ad- Survivin-D71A可为前列腺癌的基因治疗提供新的重要手段。