低温胁迫下野牛草生理生化响应及蛋白质组学研究

论文摘要

野牛草（Buchloe dactyloide （Nutt.） Engelm）,是一种禾本科暖季型草坪草,起源于北美西部大草原,自20世纪50年代引入北京以来,一直是本市环境绿化,水土保持的重要草坪草种。与冷季型草坪草和大多数暖季型草坪草相比,野牛草具有耗水少,需肥量小,不需频繁修剪,抗旱、抗病性强,养护费用极低,环境污染小等优点,属理想的“节水环保型”草坪草,但野牛草的缺点之一是在北方地区绿期短,不耐寒冷,使其在我国广大北方地区的应用受到限制。因此,研究低温胁迫对野牛草生理生化机制的响应及差异蛋白质的表达特性,对了解野牛草的抗寒调节机理具有重要的理论意义。目前,国内外均未见上述研究报道。本研究利用植物生理生化的研究手段,并结合蛋白质组学研究技术（双向电泳技术、质谱技术）,分析了在5℃低温胁迫6 h和24 h的条件下,野牛草生理生化的响应机制;对低温胁迫24 h的野牛草幼苗叶片总蛋白进行了差异蛋白质组的比较分析,以探索野牛草低温胁迫的抗性机制。研究结果如下:（1）野牛草幼苗在5℃低温胁迫6 h和24 h的条件下,叶片细胞膜系统受到一定的损伤,低温胁迫时间越长细胞膜受到的伤害越大,表现为相对电导率越大,伤害度也越大。在一定限度的胁强条件下,野牛草叶细胞膜不会造成永久性伤害;低温对野牛草幼苗根系活力的影响也较大,随着低温胁迫强度的增大,根系活力急剧降低,说明根系对维持植物正常生长发育的重要性,并可作为植物抗寒性鉴定的一项重要指标。（2）随低温胁迫时间的延长,野牛草幼苗叶片SOD、POD和CAT活性均表现为先升高后降低的变化规律。本实验中,SOD活性一直保持较高的水平;POD活性表现为波动较大,当胁迫持续到24 h时,POD活性明显降低几乎与对照持平,说明POD受低温影响更敏感;CAT活性与SOD活性变化保持一致,表现出这两种酶在低温适应性调节过程中的协同作用。（3）渗透调节物与野牛草幼苗低温调节机制密切相关。当遭受低温胁迫,可溶性糖含量随着胁强的增大呈上升的趋势,并随着低温处理时间的延长,可溶性糖含量的增加趋于平缓;可溶性蛋白质含量受低温影响较大,随低温胁迫强度的增大,叶片中可溶性蛋白质含量明显增加。表明可溶性蛋白质在低温胁迫过程中发挥着积极的作用,从而起到对细胞的保护作用;脯氨酸含量的变化较敏感。低温处理初期,脯氨酸含量急剧上升,随着处理时间延长脯氨酸含量又缓慢降低,但整个过程中脯氨酸含量保持在较高水平,说明脯氨酸是低温胁迫调节机制中的重要调节物质;（4）在低温胁迫24 h条件下野牛草的差异蛋白质组研究中,对蛋白质样品的制备方法,双向电泳参数的选择等技术环节进行了优化,建立了适合野牛草蛋白质组学研究的技术平台。通过对双向电泳图谱的分析表明,在低温胁迫条件下,共检测到51个蛋白丰度差异表达变化在2倍以上的蛋白点,其中有7个蛋白点表达量下调,31个蛋白质点表达量上调,其中有1个蛋白质在对照组中表达,在处理组中没有表达,有12个蛋白质在处理组中表达,在对照组中未表达。从中挑选了13个蛋白点进行了MALDI-TOF-MS分析,有8个蛋白质点得到了鉴定,其中有3个蛋白质点与能量代谢有关,1个蛋白质点与脂肪酸代谢有关,1个蛋白质点与信号转导有关,并鉴定出3个未定名蛋白和假想蛋白。表明这些蛋白质参与了多个代谢过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 植物抗寒性研究进展
• 1.1 低温胁迫对植物膜系统稳定性的影响
• 1.2 低温胁迫对植物保护酶活性的影响
• 1.3 低温胁迫对植物光合作用的影响
• 1.4 低温胁迫对植物渗透调节物质的影响
• 1.4.1 低温胁迫对植物可溶性蛋白质含量的影响
• 1.4.2 低温胁迫对植物体内可溶性糖变化的影响
• 1.4.3 低温胁迫对植物体内脯氨酸含量的影响
• 1.5 低温胁迫对植物分子反应机制的影响
• 2 植物蛋白质组学研究进展
• 2.1 蛋白质组学的产生背景和相关概念
• 2.2 蛋白质组学的发展现状及研究策略
• 2.3 蛋白组学研究的方法和技术
• 2.3.1 蛋白质样品的制备
• 2.3.2 蛋白质组样品的分离和分析
• 2.3.3 蛋白点的检测
• 2.3.4 图像分析
• 2.3.5 蛋白质的鉴定技术
• 2.3.6 生物信息学分析
• 第二章 低温胁迫对野牛草幼苗叶片中渗透调节物和保护酶活性的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞膜伤害度测定
• 2.2.2 超氧化物歧化酶活性测定
• 2.2.3 过氧化物酶活性测定
• 2.2.4 过氧化氢酶活性测定
• 2.2.5 可溶性蛋白质含量的测定
• 2.2.6 可溶性糖含量测定
• 2.2.7 游离脯氨酸含量的测定
• 2.2.8 根系活力的测定
• 2.3 结果分析
• 3 讨论与结论
• 3.1 低温胁迫对野牛草幼苗细胞膜系统稳定性的影响
• 3.2 低温胁迫对野牛草幼苗保护酶系统的影响
• 3.3 低温胁迫对渗透调节物质的影响
• 3.3.1 低温与可溶性糖含量的关系
• 3.3.2 低温与脯氨酸含量的关系
• 3.3.3 低温与可溶性蛋白质含量的关系
• 4 结论
• 第三章 野牛草蛋白质双向电泳技术平台的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 化学试剂
• 1.2 材料
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 样品制备
• 1.4.2 蛋白质样本处理
• 1.4.3 双向电泳
• 1.4.4 染色
• 1.4.5 凝胶扫描
• 1.4.6 图像分析
• 2 结果分析
• 2.1 不同蛋白质制备方法对双向电泳的影响
• 2.2 等电聚焦运行参数的选择
• 2.3 不同pH 范围的IPG 胶条双向电泳图谱的比较
• 3 讨论
• 3.1 蛋白质制备方法
• 3.2 蛋白质样品的沉淀与定量
• 3.3 双向电泳参数
• 3.4 不同pH 范围的IPG 胶条的选择
• 4 小结
• 5 建议
• 第四章 低温胁迫条件野牛草蛋白质的双向电泳及图谱分析
• 1 材料和方法
• 1.1 野牛草的培养
• 1.2 野牛草蛋白的提取
• 1.3 蛋白质双向电泳
• 1.4 电泳凝胶染色
• 1.5 双向电泳图像扫描与分析
• 2 结果
• 2.1 低温胁迫条件下野牛草叶片总蛋白双向电泳分析
• 2.2 低温胁迫条件下差异表达蛋白的丰度变化
• 3 讨论
• 3.1 差异蛋白点在凝胶图谱上的分布
• 3.2 低温胁迫条件下的双向电泳分析
• 4 小结
• 第五章 低温胁迫条件下差异蛋白的质谱鉴定及功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 化学试剂与耗材
• 1.2 双向电泳及考马斯亮蓝染色
• 1.3 图像扫描和分析
• 1.4 差异表达蛋白点质谱鉴定
• 1.4.1 质谱样品制备
• 1.4.2 胰酶解肽段混合物的MALDI-TOF-MS 检测
• 1.4.3 数据库查询
• 1.5 生物信息学分析
• 2 结果
• 2.1 差异表达的蛋白质鉴定结果
• 2.2 鉴定的蛋白质在等电点和分子量方面与理论值的比较
• 2.3 差异表达蛋白质的生物信息学分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历