绒山羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

论文摘要

该研究将20～45日龄的绒山羊胚胎生殖嵴及其邻近组织用机械剪碎和胰蛋白酶+EDTA消化处理,未加任何生长因子,仅添加DMEM（低糖）+10%FBS犊牛血清,在38.0℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下,将原始生殖细胞（PGCs）与其胎儿成纤维细胞共培养,其结果:在原代培养至6天时观察到了由PGCs分裂增殖而成的鸟巢状绒山羊类胚胎干细胞（ES细胞）集落,贴壁生长于成纤维细胞层上面。这些集落的细胞经6代克隆传代具有胚胎干细胞的诸多特征。有连续传代的能力（传至6代）。细胞集落有典型的鸟巢状结构,AKP染色阳性,核型分析结果染色体正常。在透射电镜下细胞体积小,核大,有多个核仁而且核仁明显,细胞形态不规则,无明显界限。细胞质中核糖体较多,内质网、线粒体发大、部分细胞的核膜上出现小泡、染色质边集而形成凋亡小体。上述表明该细胞具有多能性,类似ES细胞。

论文目录

• 1 引言
• 1.1 干细胞研究现状
• 1.2 胚胎干细胞的研究进展
• 1.2.1 胚胎干细胞的概念及研究状况
• 1.2.2 国内胚胎干细胞研究现状
• 1.2.3 绵羊胚胎干细胞及绒山羊胚胎干细胞的研究状况
• 1.2.4 胚胎干细胞的研究意义
• 1.3 原始生殖胞（PGCs）的生物学来源、迁移和增殖
• 1.3.1 PGCs 的分离
• 1.3.2 PGCs 的培养
• 1.3.3 PGCs 的纯化
• 1.4 原始生殖细胞用于建立类ES 细胞的概况
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验药品与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 溶液的配制
• 2.2.2 绒山羊胚胎成纤维细胞的分离培养
• 2.2.3 绒山羊胚胎成纤维细胞的传代培养
• 2.2.4 绒山羊PGCs 的培养和ES 细胞的分离与克隆
• 2.2.5 绒山羊胚胎干细胞的传代培养
• 2.2.6 AKP 染色
• 2.2.7 电镜超薄切片制备步骤
• 2.2.8 核型分析
• 3 实验结果
• 3.1 绒山羊胚胎成纤维细胞的分离培养
• 3.1.1 原代培养的生长行为
• 3.1.2 继代培养的生长行为
• 3.2 绒山羊PGCs 的分离与培养
• 3.2.1 绒山羊 PGCs 的生长行为
• 3.2.2 绒山羊 PGCs 传代后的生长行为
• 3.3 类 ES 细胞的鉴定
• 3.3.1 AKP 染色鉴定
• 3.3.2 核型分析鉴定
• 3.3.3 透射电镜观察
• 4 讨论
• 4.1 ES 细胞在体外培养时的影响因素
• 4.2 早期胚胎选择和PGCs 的分离
• 4.3 关于ES 细胞的凋亡
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介