神经生长因子受体p75NTR抑制肝癌生长的机制研究

论文摘要

p75NTR（p75 neurotrophin receptor）是神经生长因子（neurotrophin, NT）的低亲和力受体,由427个氨基酸组成,属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFR）的一员。p75NTR不仅在神经系统的发育中起重要作用,而且在肿瘤的发生发展中也起重要作用。既往的研究表明,p75NTR是一个潜在的抑癌基因,它可以抑制前列腺癌细胞的生长。然而有报道认为p75NTR也可以作为生存受体促进黑色素瘤细胞的脑转移,这一矛盾提示p75NTR在不同的肿瘤中可能发挥了不同的作用。我科先前的研究发现,p75NTR在胃癌中的表达显著低于癌旁组织,p75NTR可以抑制胃癌的侵袭和转移。迄今为止,p75NTR在肝癌中的表达情况及在肝癌生长中的作用尚不清楚,本课题将对此进行探讨。【目的】1、研究p75NTR在肝癌及癌旁组织中的表达情况;2、研究p75NTR对肝癌细胞生长的影响;3、探讨p75NTR诱导肝癌细胞周期阻滞的可能机制。【方法】1、利用免疫组化方法研究p75NTR在肝癌及癌旁组织中的表达。2、Western Blot方法检测肝癌细胞系和正常肝细胞系中p75NTR的表达。3、通过基因重组方法构建p75NTR的siRNA载体,转染Chang细胞,G418筛选,获得稳定克隆。构建p75NTR的正义表达载体,转染HepG2细胞,G418筛选,获得稳定克隆。4、对稳定转染的细胞利用Western blot技术鉴定不同载体的转染效果。5、MTT法绘制转染细胞及对照细胞的生长曲线。6、流式细胞仪分析转染细胞和对照细胞的细胞周期分布。7、利用Hoechst33258染色法和流式细胞仪分析法检测转染细胞的凋亡百分率。8、软琼脂克隆形成实验观察转染细胞和对照细胞在体外的成瘤能力。9、裸鼠成瘤实验观察转染细胞及其对照细胞的体内成瘤能力。10、用Western blot法检测转染细胞中细胞周期相关分子表达水平的变化。【结果】1、利用免疫组化技术检测了p75NTR在肝癌和癌旁组织中的表达,发现p75NTR在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织,肝癌的分化程度越低、临床分期越差则p75NTR的表达也越低。2、Western Blot方法检测肝癌细胞系和正常肝细胞系中p75NTR蛋白的表达,发现p75NTR在正常肝细胞系中表达较高,而在肝癌细胞系中表达较低。3、构建了p75NTR的siRNA载体,将其转染Chang细胞,G418筛选获得稳定表达的克隆,经蛋白水平检测证实成功建立了p75NTR下调的稳定细胞系。同时构建了p75NTR的正义表达载体,将其转染HepG2细胞,G418筛选获得稳定表达的克隆,经蛋白水平检测证实成功建立了p75NTR上调的稳定细胞系。4、用MTT法检测细胞生长情况,结果发现,p75NTR-siRNA转染的Chang细胞生长加快,而p75NTR正义转染的HepG2细胞生长减慢。5、细胞周期检测显示,p75NTR-siRNA转染的Chang细胞增殖指数增加,G1/S期的转换加快;而p75NTR正义转染的的HepG2细胞增殖指数降低,发生G1/S期的阻滞。6、Hoechst33258染色法和流式细胞仪分析法检测转染细胞的凋亡情况,结果发现,p75NTR正义转染的HepG2细胞的凋亡百分率增加。7、软琼脂克隆形成实验显示,p75NTR正义转染的HepG2细胞生长减慢,克隆形成率显著低于对照细胞。8、裸鼠体内成瘤实验结果显示,p75NTR正义转染的HepG2细胞的成瘤性显著低于对照细胞。9、Western blot检测转染细胞的细胞周期相关分子发现,p75NTR表达的下调使PCNA、Cyclin D1和p-Rb的表达上调,但使Rb的表达下调;p75NTR表达的上调使PCNA、Cyclin D1和p-Rb的表达下调,但使Rb的表达上调。这提示p75NTR通过上述机制引起了G1/S期的阻滞。【结论】1、p75NTR在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织,肝癌的分化程度越低、临床分期越差则p75NTR的表达就越低。2、p75NTR可以抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡,从而抑制了肝癌细胞的生长和成瘤能力。3、p75NTR能够通过下调Cyclin D1、p-Rb和PCNA的表达和上调Rb的表达来诱导肝癌细胞的G1/S期阻滞,从而抑制了肝癌的生长。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 p75NTR 在肝癌中的表达
• 1 材料和仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 p75NTR 对肝癌细胞生长的影响
• 1 材料和仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 p75NTR 诱导肝癌细胞周期阻滞的机制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢