论文摘要
丙型肝炎流行广泛、危害严重。全球约有1.7～2.0亿（约3%）人口感染HCV,我国HCV感染人数约4000多万,占总人口的2～3%。高效的病毒培养体系和合适小动物模型的缺乏,严重阻碍了我们对病毒病原学及其感染机制的了解,使丙型肝炎疫苗和抗病毒药物的研究与开发举步维艰。树鼩（tree shrew,Tupaia belangeri）是一种体形小、繁殖快、易于饲养、广泛分布于我国西南部及东南亚一带、在分类学上介于食虫目和灵长目之间的动物,已知对多种医学病毒易感。树鼩对丙型肝炎病毒的易感性已被多项国内外研究结果所证实,有希望成为丙型肝炎研究的动物模型。树鼩原代肝细胞分离培养及其对HCV的易感性确定,是建立丙型肝炎树鼩动物模型的重要组成部分,并可为研究丙型肝炎病毒感染与疾病慢性化机制,及疫苗研制与药物开发提供必要工具。本研究以经驯化的野生树鼩为对象,采用半原位的二步灌流、胶原酶消化法分离获得树鼩原代肝细胞,并成功进行了培养。实验采用血液循环同向的门静脉——下腔静脉灌流方向,以无钙镁的Hepes液为预灌流液灌流至肝脏灰白色、血细胞冲洗干净,以0.025%的胶原酶Ⅳ溶液为消化液,灌流速度为5～20ml/min;胶原酶37℃消化18分钟为宜,可以得到散在的树鼩肝细胞。经洗涤离心,每次分离细胞产量达5×108以上,细胞纯度达95%以上,细胞成活率为90%,可以满足细胞培养和HCV感染试验要求。对分离得到的树鼩原代肝细胞用多种培养基进行培养,经细胞生长形态观察,确定MEM+5%NCS+10ng/ml EGF+10ng/ml HGF为最佳培养基,适合树鼩原代肝细胞的长期培养。培养过程中,细胞经2天左右的潜伏期,很快进入对数增长期,第3至第8天细胞增殖与生长状态最好,经定期补充培养基,细胞成活可达25天之久。采用常规的细胞胰酶消化传代、血清-DMSO冻存和复苏方法,对树鼩原代肝细胞进行传代与复苏,但传代细胞再次贴壁效果不好,复苏细胞几乎不再贴壁,方法有待改进。用经质粒转染Hela细胞培养获得的HCV病毒,感染生长良好的树鼩原代肝细胞,经HCV特异性正链、负链检测发现:在培养上清中,从第1天到第18天可以间歇性地检测到HCV RNA正链;在培养细胞中,从第3天到第15天可以间歇性地检测到HCVRNA负链。采用含有绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因、Luciferase（荧光素酶）基因的HCVpp和HCVcc来感染树鼩原代肝细胞,在荧光显微镜下可以观察到HCVpp-EGFP感染细胞发出的绿色荧光,HCVpp-Luciferase感染的细胞经荧光素酶检测为阳性,同时通过免疫荧光检测证实了HCV抗原在感染细胞中的存在。本研究建立了成熟的树鼩原代肝细胞分离、培养方法,初步证实了培养的树鼩原代肝细胞对不同来源、特性的HCV病毒的易感性,为HCV感染机制研究、药物、疫苗的研发奠定了基础,并为树鼩可以成为丙型肝炎动物模型提供了佐证。