G9型猪轮状病毒VP2/4/6/7蛋白真核表达及组装病毒样颗粒研究

论文摘要

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PRV）属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。小日龄动物最为易感，人、猪、火鸡、绵羊等多种动物都是轮状病毒的自然宿主。轮状病毒引起的腹泻是一种世界性疾病，给人类健康和畜牧业发展造成严重危害。目前，虽然有PRV疫苗可用于该病的预防，但还未有效控制该病流行，迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫机制来预防和控制PRV感染发病。病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）在病毒形态上与真正病毒相同或相似，具有良好的免疫原性和反应原性，在疫苗研究上有广阔应用前景。国外已经有成功组装PRV VLPs的研究报道，且在疫苗研究、动物免疫试验中都取得了可喜的成果，为本实验提供了切实可行的理论依据。本研究参考GenBank已发表的PRV G5型OSU毒株VP4／6／7全长基因组序列和5株人源PRV VP2全长基因序列，分别设计合成4对引物对我国江苏分离的PRV毒株（简称JS毒株），采用RT-PCR方法扩增全基因片段，为了对VP2基因进行生物学特性分析，因此又扩增完成了OSU毒株VP2全基因片段。将扩增基因分别克隆到pMD18-T载体，筛选阳性重组质粒序列测定。测序结果显示：JS毒株与OSU毒株VP2全基因序列均为2717bp，编码890个氨基酸，同源性比较发现二者核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为99.91％，虽然二者与人wa毒株VP2基因同源性最高，但通过系统发育进化树分析，发现其与猪源HP140毒株的亲缘关系最近；VP4基因全长2342 bp，编码776个氨基酸，15株PRV A群VP4全基因序列进行同源性比较，核苷酸同源性分别在69.2～99.5％，推导氨基酸同源性在70.2～99.1％之间，氨基酸45～250位变异率较高，有突变、插入和缺失现象，其中胰酶作用位点氨基酸241、247位高度保守，系统发育进化树分析，JS毒株与OSU、JL94毒株亲缘关系最近；VP6全基因序列1320bp，编码389个氨基酸，9株PRV VP6全基因同源性比较，核苷酸同源性在77.1％～91.1％之间，氨基酸的同源性在89.7％～99.5％之间，系统发育进化树显示，10株PRV可以分为4个群，JS毒株与B131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近，为一个群；VP7基因全长1062bp，编码326个氨基酸，与已知的15个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较，同源性分别为74.5％～78.5％和75.2％～83.1％之间，核苷酸系统发育进化树结果发现，JS毒株与RV G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近，为一个进化群，表明JS毒株血清型为G9型。根据测序结果重新设计合成另4对引物，上游均含BamHⅠ酶切位点，下游均含SalⅠ酶切位点的，以鉴定阳性重组质粒为模板扩增目的片段后，分别克隆至真核表达载体pFastBac的BamHⅠ、SalⅠ之间的多克隆位点。经酶切、PCR和序列测定鉴定正确后，将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，在其转座酶作用下进行转座，得到Bacmid-VP2／4／6／7重组基因组。纯化后与脂质体共转染sf9细胞，72小时后收获重组病毒，盲传3代后提取重组病毒DNA进行PCR鉴定。SDS-PAGE、Western blot分析，表明PRV JS毒株VP2、VP4蛋白获得表达并具有良好的生物学特性。为了研究PRV VLP的形态学特性，VP2重组病毒单独转染sf9细胞，培养物上清经蔗糖密度梯度离心纯化后，电镜负染观察到直径约40nm左右的核心样颗粒，在形态、直径大小上都接近真实的病毒粒子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 轮状病毒概述
• 1.1.1 轮状病毒生物学特性
• 1.1.2 RV的理化特性
• 1.1.3 RV的培养特性
• 1.1.4 RV血清群和血清型
• 1.1.5 RV的分子生物学特性
• 1.1.6 RV蛋白及其作用
• 1.1.7 RV疫苗的研究进展及存在问题
• 1.2 病毒样颗粒概述
• 1.2.1 VLPs在基础研究中的应用
• 1.2.2 VLPs在囊膜病毒出芽过程中的研究
• 1.2.3 VLPs在免疫预防和疫苗开发中的应用
• 1.2.4 作为免疫原
• 1.2.5 作为治疗性疫苗
• 1.2.6 VLPs疫苗
• 1.2.7 血清学诊断
• 1.2.8 存在的问题与展望
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 阳性血清、阴性血清
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要仪器设备及耗材
• 2.1.6 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 PCR扩增产物电泳
• 2.2.4 目的片段回收纯化
• 2.2.5 目的片段克隆
• 2.2.6 序列测定与同源性比较
• 2.2.7 重细表达载体的构建
• 2.2.8 重组质粒Pb-VP2/4/6/7、重组Bacmid-VP2/4/6/7鉴定
• 2.2.9 重组基因组序列测定
• 2.2.10 纯化质粒与杆状病毒共转染
• 2.2.11 重组杆状病毒的噬斑纯化、鉴定与增殖
• 2.2.12 VP2/4/6/7在杆状病毒中表达产物的检测
• 2.2.13 透射电镜观察VLP结构
• 3 实验结果
• 3.1 PRVVP2/4/6/7基因的PCR扩增与克隆
• 3.1.1 RT-PCR结果
• 3.1.2 重组克隆载体PCR鉴定
• 3.1.3 阳性重组子序列测定及同源性比较
• 3.2 重组质粒Pb-VP2/4/6/7酶切及pF-VP2/4/6/7PCR鉴定
• 3.2.1 重组质粒Pb-VP2/4/6/7酶切鉴定
• 3.2.2 重组Bacmid-VP2/4/6/7PCR鉴定
• 3.2.3 重组质粒Pb-VP2/4/6/7、Bacmid-VP2/4/6/7纯化后浓度和纯度测定
• 3.3 重组质粒转染sf9细胞
• 3.3.1 重组质粒Pb-VP2/4/6/7转染sf9细胞
• 3.3.2 重组Bacmid-VP2/4/6/7转染sf9细胞
• 3.3.3 重组杆状病毒鉴定
• 3.4 真核表达及表达产物的检测
• 3.4.1 SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）检测表达产物
• 3.4.2 Westrenblot检测表达蛋白
• 3.5 透射电镜观察VLP结构
• 4讨论
• 4.1 PRV血清型及进化
• 4.2 PRV JS毒株结构蛋白分子特性分析
• 4.2.1 核衣壳蛋白VP2
• 4.2.2 血凝素抗原VP4
• 4.2.3 群抗原VP6
• 4.2.4 中和抗原VP7
• 4.3 目的蛋白杆状病毒/昆虫细胞的真核表达
• 4.4 VLP形成及其免疫
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文