用酵母双杂交系统从大鼠心肌细胞cDNA文库中筛选与血管紧张素-（1-7）相互作用的因子

论文题目: 用酵母双杂交系统从大鼠心肌细胞cDNA文库中筛选与血管紧张素-（1-7）相互作用的因子

论文类型: 博士论文

论文专业: 内科学

作者: 王文艳

导师: 陈君柱

关键词: 血管紧张素,血管紧张素,酵母双杂交系统,蛋白蛋白相互作用

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目的:血管紧张素-(1-7)[angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]是一种具有重要生物学活性的七肽激素。本文应用酵母双杂交系统从大鼠心肌细胞cDNA文库中筛选与Ang-(1-7)相互作用的蛋白,为该七肽如何在体内的发挥功能提供线索。方法:全基因合成大鼠野生型Ang-(1-7)片断作为诱饵,在两侧添加限制性酶切位点EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ,将扩增后的诱饵片断克隆至pBD-GAL4 cam的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点之间,构建Ang-(1-7)的真核表达载体(诱饵载体)pBD-Ang-(1-7)。乙酸锂法将诱饵质粒转化酵母菌YGR-2,涂布于相应的营养缺失的培养基(SD/trp~-),进行毒性和自身激活检验。大鼠心肌细胞噬菌体文库HybriZAP-2.1经大量切割形成质粒文库pAD-GAL4 Cam。诱饵质粒与大鼠心肌细胞质粒文库先后转化酵母细胞,在3重营养缺陷培养基(SD/trp~-leu~-his~-)上进行双杂交筛选,并进行β-gal活性检测。选择既能在3重营养缺陷培养基上生长,同时具有β-gal活性能使X-gal变蓝的酵母克隆为阳性克隆。从阳性酵母中提取质粒转化大肠杆菌后进行抗性筛选,再与对照质粒成对回复杂交排除假阳性。扩增真阳性靶质粒的插入片断进行DNA测序和生物信息学分析。结果:成功构建诱饵载体pBD-Ang-(1-7),测序结果证实Ang-(1-7)cDNA已正确克隆到pBD-GAL4多克隆位点,重组克隆的重组方向及开放阅读框架均正确无误,Ang-(1-7)七肽在YGR-2酵母中正常表达。诱饵载体对酵母无毒性,无自身激活报告基因的功能。经系列筛选最后得到6个有意义的阳性靶质粒。靶基因测序结果与在网上进行BLAST对比,显示目的基因所编码的靶蛋白包括结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,ctgf)、真核细胞翻译延伸因子(Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha)、TATA盒结合蛋白协同因子(TBP associated factor,TAF)、脂肪酸

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

血管紧张素—(1—7)与心皿管疾病的关系

参考文献

血管紧张素与心律失常

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-14

参考文献

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用酵母双杂交系统从大鼠心肌细胞cDNA文库中筛选与血管紧张素-（1-7）相互作用的因子

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