贵州白山羊GDF9基因多态性及其与高繁殖力关系的研究

论文摘要

繁殖性状是家畜的重要的经济性状之一,因此提高家畜的产仔（羔）数具有重要的现实意义。由于山羊的产羔数遗传力很低（仅为0.10）,用常规的育种技术对产羔数性状的改变难以提高,所以寻找控制山羊繁殖率的主效基因及其遗传标记的研究已是许多育种专家关注的焦点。目前,在部分绵羊中已经找到了影响繁殖性状的主效基因,但它们的精确定位及在多数绵羊、山羊品种中的遗传学作用尚未见报道,还需要对此进行深入的探索。应用基因工程方法,克隆了贵州白山羊生长分化因子9（GDF9）外显子2,其片段长度为965bp,编码321个氨基酸,包含了成熟肽的135个氨基酸。与济宁青山羊、绵羊、人、负鼠GDF9外显子2的碱基序列比对后,相似性分别为99%、99%、84%、74%。说明该基因在各物种间同源性比较高。采用PCR-RFLP技术检测GDF9基因的限制片断长度多态性。结果表明:在高产和低产母羊、公羊中都没有发现FeeGH突变（S77F）。采用PCR-SSCP技术对GDF9基因外显子2编码的成熟肽序列进行多态性检测。结果表明:在高繁殖率（3羔以上/胎）母羊和公羊中检测到8个杂合的AB基因型,其中5个为高产的母羊,3个为公羊。碱基序列分析证实GDF9基因编码区第1189bp位点的碱基由G突变为A,导致活性肽第79位缬氨酸突变为异亮氨酸（V79I）,但在低繁殖率（1-2羔/胎）母羊中没有发现该突变。虽然贵州白山羊GDF9基因中G1189A突变的发生率仅为3%,但该位点编码的氨基酸与FecGH突变（S77F）仅相隔一个氨基酸,因此推测GDF9基因中的G1189A突变可能与贵州白山羊的高繁殖力有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 一 前言
• 1.1 候选基因分析方法概述
• 1.1.1 候选基因的选择
• 1.1.2 引物设计及基因相应片段的扩增
• 1.1.3 候选基因多态位点的寻找
• 1.1.4 候选基因与表型性状间的连锁分析
• 1.1.5 候选基因法的优缺点
• 1.2 GDF9基因研究进展
• 1.2.1 GDF9的结构、功能及调控
• 1.2.2 GDF9基因在染色体的位置
• 1.2.3 GDF9基因的结构
• 1.2.4 GDF9基因的发育性表达
• 1.2.5 GDF9基因的多态性
• 1.2.6 GDF9基因与FSH的关系
• 1.2.7 GDF9基因与GDF-9B基因在卵巢功能中的协同作用
• 1.2.8 GDF9基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 1.3 候选基因DNA多态性检测方法
• 1.3.1 限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism,RFLP）
• 1.3.2 单链构象多态性（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）
• 1.4 贵州白山羊
• 1.4.1 品种的形成
• 1.4.2 品种分布和产区概况
• 1.4.3 品种特点
• 1.4.4 生产性能
• 二 研究的目的与意义
• 三 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验样本的来源及采样方法
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 提取动物基因组DNA用缓冲液和试剂
• 3.1.5 琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂
• 3.1.6 感受态细胞制备及转化相关试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验样品DNA的提取
• 3.2.2 PCR引物的选择及PCR反应条件的确定
• 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• H突变的PCR-RFLP分析'>3.2.4 GDF9基因FecG^H突变的PCR-RFLP分析
• 3.2.5 GDF9基因外显子2的PCR-SSCP分析
• 3.2.6 GDF9基因外显子2及其不同基因型的克隆测序
• 3.3 分析软件
• 四 结果与分析
• 4.1 基因组的提取结果
• 4.2 GDF9基因外显子2扩增与分析
• 4.2.1 GDF9基因外显子2PCR扩增结果
• 4.2.2 重组质粒的构建和鉴定
• 4.2.3 GDF9基因外显子2的核苷酸序列测定及分析
• H突变序列的扩增及PCR-RFLP多态性检测'>4.3 GDF9基因FECG^H突变序列的扩增及PCR-RFLP多态性检测
• H突变序列的PCR扩增'>4.3.1 GDF9基因FecG^H突变序列的PCR扩增
• 4.3.2 PCR-RFLP分析
• 4.4 GDF9基因外显子2成熟肽序列的扩增及PCR-SSCP多态性分析
• 4.4.1 GDF9基因外显子2成熟肽序列的PCR扩增
• 4.4.2 PCR-SSCP分析
• 4.4.3 GDF9不同基因型的碱基序列分析
• 4.4.4 GDF9不同基因型的三维结构分析
• 4.4.5 GDF9基因外显子2的基因型频率和基因频率
• 五 讨论
• 5.1 实验材料的选择
• 5.2 贵州白山羊GDF9基因外显子2分析
• 5.3 GDF9基因的多态性分析
• 5.4 影响PCR-SSCP检测的因素
• 5.4.1 PCR产物的质量
• 5.4.2 DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响
• 5.4.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶成分
• 5.4.4 上样缓冲液与变性
• 5.4.5 电泳条件
• 5.4.6 其它因素
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 附录一
• 附录二
• 致谢