兔骨髓间充质干细胞分离培养及定向分化的研究

兔骨髓间充质干细胞分离培养及定向分化的研究

论文摘要

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)起源于中胚层,主要存在于哺乳动物的骨髓中,与造血干细胞(Hemopoietic stem cells,HSCs)共存。BMSCs不仅参与构建造血微环境,发挥支持造血的作用,而且易于体外分离培养和扩增、可自体移植并具有跨胚层分化为多种细胞类型的能力,未分化的或经遗传修饰过的BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的理想种子细胞。本研究目的在于阐明兔BMSCs的生物学特性,优化兔BMSCs的增殖培养条件,并研究其分化为脂肪细胞的潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此,本试验利用一月龄日本大白兔为对象,较为系统全面地研究了其BMSCs的分离、培养、扩增、鉴定、形态学、生长特性及体外诱导分化能力,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下实验基础。1.本试验应用红细胞裂解液法,根据骨髓间充质干细胞在培养瓶中贴壁生长的特点,成功分离得到兔股骨和胫骨MSCs,体外培养至第7代。本试验所分离的兔BMSCs,增殖能力强,体外适应性较好,通过绘制细胞生长曲线、测定24h贴壁率得出,随着传代次数的增多,增殖能力下降,贴壁时间延长,选用前4代传代细胞作为进一步的研究对象最为合适;经免疫组化实验得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达,CD34阴性,可初步鉴定所分离的细胞为兔BMSCs,为进一步的实验奠定基础。2.本试验通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)比较不同培养基及血清浓度对兔BMSCs生长的影响,结果发现不加血清时,细胞在LG-DMEM和DMEM/F12中的生长速度没有显著差异( P >0.05),加血清后,细胞在DMEM/F12中的生长速度均比在LG-DMEM中的生长速度快(P﹤0.05),其中兔骨髓间充质干细胞在DMEM/F12+20%FBS培养基中生长速度最快。另外,在LG-DMEM+10% FBS培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过MTT法来检测bFGF对体外培养的兔骨髓MSCs增殖的影响,结果表明,bFGF具有促进体外培养的兔BMSCs增殖的作用,其促增殖效应与其质量浓度关系密切:5~20μg/L效应不明显(P>0.05),在40~100μg/L时促增殖效应显著(P <0.05),在80μg/L时其促增殖效应最强(P <0.01)。通过检测细胞周期分析bFGF促进兔BMSCs增殖的机理,结果表明,添加bFGF组的细胞中处于S+G2/M期(增殖指数)的细胞百分率为(32.83±1.47)%,与对照组(17.19±1.38)%相比明显增加(P﹤0.01)。3.联合应用地塞米松、胰岛素体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞分化,诱导7d后细胞内有脂滴,随着时间延长,脂滴逐渐增加并融合为脂泡,细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为椭圆形或多角形,胞核被挤向一侧,油红O染色呈阳性,从而建立了MSCs分化为脂肪细胞的模型,有助于研究肥胖发生的机制。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • 文献综述
  • 1 骨髓间充质干细胞的研究进展
  • 1.1 骨髓间充质干细胞的发现及其命名
  • 1.2 骨髓间充质干细胞的生物学特性
  • 1.3 骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养扩增
  • 1.3.1 MSCs 的分离纯化
  • 1.3.2 MSCs 的培养扩增
  • 1.4 骨髓间充质干细胞的鉴定
  • 1.4.1 形态学
  • 1.4.2 MSCs 的表面标志
  • 1.4.3 免疫细胞化学技术
  • 1.4.4 流式细胞技术
  • 1.5 骨髓间充质干细胞的可塑性
  • 1.5.1 MSCs 向成骨细胞的定向诱导分化
  • 1.5.2 MSCs 向软骨细胞的定向诱导分化
  • 1.5.3 MSCs 向脂肪细胞的定向诱导分化
  • 1.5.4 MSCs向神经细胞的定向分化
  • 1.5.5 MSCs向肝细胞的定向诱导分化
  • 1.5.6 MSCs向肌腱组织分化
  • 1.5.7 MSCs向表皮细胞分化
  • 1.6 骨髓间充质干细胞的应用前景及存在的问题
  • 1.6.1 应用前景
  • 1.6.2 存在的问题
  • 试验一 兔骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及生物学特 性的研究
  • 引言
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 主要溶液配制
  • 1.3 试验方法
  • 1.4 统计学处理
  • 2 结果与分析
  • 2.1 原代培养
  • 2.2 传代培养
  • 2.3 兔骨髓间充质干细胞的鉴定
  • 2.4 传代兔骨髓间充质干细胞生长曲线的测定
  • 2.5 传代细胞贴壁率
  • 3 讨论
  • 3.1 兔骨髓间充质干细胞的分离培养
  • 3.2 传代次数对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响
  • 3.3 兔骨髓间充质干细胞的鉴定
  • 4 小结
  • 试验二 兔骨髓间充质干细胞体外扩增培养影响因素的实 验研究
  • 引言
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 主要溶液配制
  • 1.3 试验方法
  • 1.4 统计学处理
  • 2 结果与分析
  • 2.1 兔 BMSCs 体外培养基的筛选
  • 2.2 MTT 比色实验测得 bFGF 对兔 BMSCs 的促增殖效应
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 试验三 兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为脂肪细胞的 研究
  • 引言
  • 1 材料与方法
  • 2 结果与分析
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 英文缩写词表
  • ABSTRACT
  • 作者简介
  • 相关论文文献

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