论文摘要
目前,艾滋病已成为影响人类健康的最严重的传染性疾病之一。世界各国严峻的流行形式迫切需要研制出安全有效的预防性艾滋病疫苗。疫苗的安全性、有效性以及免疫策略需要在合适的动物模型中进行评价。其中,SHW/印度恒河猴艾滋病模型是应用最为广泛的动物模型之一。包含中国HIV-1 CRF07 BC主要流行株基因CCR5嗜性的致病性SHIV/中国恒河猴艾滋病模型在基于中国HIV-1主要流行株设计的艾滋病疫苗免疫保护效果评价中可以发挥非常重要的作用。SHIV-XJ02170感染性分子克隆是以B亚型强毒株SHIV-KB9基因为框架重组入中国CRF07 BC亚型HIV-1主要流行株env基因构建而成,本研究将SHIV-XJ02170连同Ruth M Ruprecht教授惠赠的另一株包含CRF07 BC亚型HIV-1 env的SHIV-CN97001分别在中国恒河猴体内快速传代。经过近4年的连续猴体传代和长期适应后,通过病毒载量和外周血CD4+T淋巴细胞计数分析未发现致病性强毒株的出现。不过,两株SHIV病毒在猴体传代过程中表现出病毒毒力增强的特点。其中,SHIV-CN97001在前3代中病毒复制能力持续升高。更为重要的是,SHIV-XJ02170传代中的两只动物表现出潜伏期稳定的低水平病毒血症过程。为了分析SHIV-CN97001和SHIV-XJ02170传代过程中序列变异特点,扩增各代动物急性期病毒载量峰值时间点病毒RNA Gp120克隆序列并分析病毒准种之间的基因离散率和遗传多样性。SHIV-CN97001传代过程中基因距离表现出先升后降的趋势,其中第三代动物中基因离散率和遗传多样性最显著。SHIV-XJ02170传代中的408动物体内病毒相对于原始序列基因离散率在适应过程中持续上升。分析发现各代动物基因离散率和病毒复制能力之间存在相关性。基因多态性分析发现两株SHIV病毒Gp120 V3区在传代过程中均最为保守。基于V3区关键氨基酸位点分析发现所有RNA克隆序列均利用CCR5作为辅助受体,传代过程中未发生改变。总体而言,SHIV-CN97001和SHIV-XJ02170传代过程中Gp120基因距离未出现明显上升,并且每代动物传代早期出现典型的“瓶颈效应”。按照Mullins教授提出的HIV-1感染后致病过程不同阶段基因距离变化理论分析,SHIV-XJ02170在第二代动物408体内目前已经处于感染的后期阶段。病毒准种基因变异分析可以部分解释两株SHIV病毒在中国恒河猴体内传代过程中未出现致病性强毒株的原因。为建立致病性SHIV-KB9/中国恒河猴艾滋病疫苗评价模型并比较SHIV-KB9在中国恒河猴和印度恒河猴体内致病模式的差异。7只Mamu-A*01阴性的中国恒河猴静脉途径接种1-1000 MID50剂量的SHIV-KB9并监测病毒载量、CD4/CD8比值、SHIV特异性抗体滴度以及病毒序列变异。在中国恒河猴中,SHIV-KB9表现出和文献报道的印度恒河猴中相同的三种致病模式。然而,SHIV-KB9在两亚种动物中的主要致病模式是不同的。另外,SHIV-KB9感染中国恒河猴后三种致病模式中病毒血症的特点与印度恒河猴是不同的。对比发现,病毒载量和CD4+T细胞的维持能力与体液免疫反应相关。值得注意的是,在CD4+T细胞显著下降的动物体内SHIV-KB9病毒准种的基因离散率和遗传多样性明显升高。SHIV-KB9在中国恒河猴体内表现出相对印度恒河猴致病过程进展更加缓慢的特点,这一特点更加接近HIV-1在人体的致病特点并更适合做为艾滋病疫苗的评价模型。另外,SHIV-CN97001和SHIV-KB9感染中国恒河猴后可以诱导针对SHIV-KB9的异源性和同源性免疫保护反应。因此,SHIV病毒成功感染中国恒河猴后继续进行SHIV-KB9二次攻毒试验在中国恒河猴艾滋病疫苗免疫保护效果评价中是不适合的。为了控制艾滋病在中国的流行,本研究团队研制了包含中国CRF07BC亚型主要流行毒株HIV-1 CN54 gag,pol,nef以及gp140基因的DNA疫苗和复制性天坛株重组痘苗病毒载体疫苗（rTV）。为了评价本疫苗的免疫源性和攻毒保护效果并分析DNA疫苗的初免效果,采用rTV单免和DNA/rTV联合免疫两种策略免疫12只中国恒河猴,并选用同源性SHIV-CN97001和异源性SHIV-KB9二次攻毒的方式分析疫苗的免疫保护效果。免疫和攻毒后,监测细胞和体液免疫反应以及病毒载量的变化。HIV特异性结合抗体滴度和IFN-γ分泌性T细胞免疫反应分别采用ELISA和ELISPOT方法分析,中和抗体滴度通过测定SHIV-KB9在TZM-bl细胞的感染能力进行分析。相比rTV单免组,DNA/rTV联合免疫组动物疫苗免疫后可以诱导10倍以上水平的IFN-γ分泌性T细胞免疫反应,但诱导的结合抗体和中和抗体滴度水平没有明显差异。两种免疫策略均可以在最后一次痘苗免疫9个月后诱导出很强的记忆性免疫反应。同源性SHIV-CN97001病毒攻击后,rTV单免组全部4只动物均获得完全性保护的效果。然而,DNA/rTV联合免疫组3只动物中仅有1只动物获得完全性保护效果,其它2只动物获得部分性保护效果。10个月之后,两组中各挑选1只针对SHIV-CN97001完全性保护的动物进行异源性SHIV-KB9的二次病毒攻击。联合免疫组中M7动物通过病毒载量和血液传代分析依然保持完全性保护的效果,而rTV单免组M2动物仅获得部分性保护的效果,表现为急性期病毒载量峰值水平下降以及潜伏期病毒载量下降至低于最低检测限水平。分析发现在同源性SHIV-CN97001免疫保护方面中和抗体可能发挥了关键性作用,而在异源性SHIV-KB9免疫保护方面IFN-γ分泌性T细胞免疫反应和免疫保护密切相关。DNA-复制性重组痘苗病毒艾滋病疫苗免疫中国恒河猴后提供有效且持续性的免疫反应,可以有效的保护动物抵抗同源性和异源性SHIV病毒的攻击。本研究可以对艾滋病疫苗的临床试验提供有效的参考数据。