变异乙型肝炎表面抗原在毕赤酵母中的克隆表达及表面抗原诊断试剂的评价

论文摘要

乙型肝炎是一种对公共健康危害严重的疾病。近年来随着乙型肝炎疫苗和抗病毒药物的广泛使用，乙型肝炎病毒的感染和传播得到了有效的防止。但是，乙型肝炎的防治是一项长期而艰巨的任务，随着对乙肝病毒研究的深入，一些新的问题不断被发现，如免疫后人群，抗病毒药物治疗的患者中以及慢性HBV感染的人群中都出现了HBV表面抗原的变异。这些变异对免疫诊断试剂提出了新的挑战。大量文献报道了诊断试剂对变异表面抗原的漏检。但是国内对HBV变异的流行病学及变异对国产诊断试剂影响的研究还较少。本研究第一部分利用已构建好的野生型及3个HBV S区变异的质粒（T126N，D144A，G145R）作为模板，设计含有特定酶切位点的引物，进行PCR后用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切回收的PCR产物，连接入酵母表达质粒pPICZA和pPICZα，构建出HBV S区野生及变异酵母表达质粒。测序结果显示，读码框架及核苷酸序列均正确。利用SalⅠ酶切构建好的6种表达质粒（胞内表达4种，分泌表达2种）使之成为线性片断。电穿孔转化P．pastroris酵母细胞GS115，用高浓度抗生素Zeocine（2000ng／ml）加压筛选出高效表达的含有多拷贝整合的菌株。对于筛选出的高抗性的菌株，经甲醇诱导表达后，用玻璃珠破碎法裂解酵母细胞，释放菌体内的表达产物。各菌株的裂解液稀释相同的倍数，用雅培公司的HBsAg试剂ARCHETECT对表达的HBsAg定量，并利用确证试剂进行确证，结果均为阳性。选择表达量高的菌株进行大量表达。表达产物以多克隆抗体作为一抗，使用免疫印迹法（Western blot，WB）检测4种表达产物，结果证明表达产物为HBsAg。本研究的第二部分是利用各种HBsAg对国内外诊断试剂进行评价。为了确保实验结果的可靠性，排除由于实验操作问题对结果的影响，我们对ELISA实验操作进行了规范，选择了一份HBV表面抗原强阳性血清倍比稀释后，作为检测用血样。利用各家诊断试剂对血样于不同时间进行了10次检测，最后结果统计显示试验的重复性及精确性都己达到要求。并且，在以后利用变异抗原对诊断试剂进行评价时，仍然将此血清作为内标以控制试验操作的一致性。将酵母表达的抗原和我们收集到的CHO细胞和小鼠L细胞表达的抗原稀释到一定的浓度，用各种HBsAg诊断试剂进行检测，对国内外诊断试剂进行评价。结果发现国产诊断试剂对HBV野生型不同亚型的检测灵敏度与进口试剂相差了约4-32倍。而对多种不同变异抗原的检测，4家国产试剂均存在一定的漏检情况。并且，利用不同表达系统表达的变异抗原对诊断试剂的评价结果也是基本相同的。国产试剂对G145R变异及其相关的多点变异的检测能力弱；对T118K／P120Q，Q129R／M133T等联合变异的检测能力亦有待于提高；而对于T126N，D144A等单点变异国内外试剂的检测能力基本一致。同时，用含有1／4 G145R变异的血样对诊断试剂进行评价，发现与以上相同的结论，国产试剂的检测灵敏度下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 变异乙型肝炎表面抗原在毕赤酵母中的克隆表达
• 前言
• 试验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 第二部分 表面抗原诊断试剂的评价
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 全文总结
• 创新点
• 参考文献
• 综述 乙型肝炎病毒变异
• 英文缩略语表
• 致谢