陆地棉纤维特异表达基因的功能分析

论文摘要

棉花是世界上重要的经济作物,棉纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源。除了具有重要的经济价值,棉花纤维还是研究细胞分化、纤维素合成、细胞伸长、次生壁加厚等生命过程的理想材料。克隆这些与棉纤维发育相关的基因并阐释其功能,不仅可以深入认识棉纤维伸长和纤维素生物合成的分子机理,还可以为改良棉纤维品质的遗传工程奠定基础。我们研究了两个棉纤维特异表达基因GhAGP3（阿拉伯半乳糖蛋白基因）以及GhFLA1（类似成束蛋白的阿拉伯半乳糖蛋白基因）的表达特性。Northern和RT-PCR结果显示GhFLA1在5DPA～15DPA棉纤维中大量且特异表达,在15DPA出现表达高峰。GhAGP3在陆地棉中15DPA左右检测到很强的表达,至20DPA左右RNA积累到最大水平;在海岛棉中,直到25DPA GhAGP3的表达水平仍然在上升。两个基因的表达方式暗示GhFLA1参与初生壁发育和棉纤维细胞的快速伸长表达,GhAGP3可能更多参与次生壁的沉积过程。另外,我们还利用RNAi来研究纤维特异表达基因在棉纤维发育过程中的功能。成功构建了GhFLA1和GhAGP3两个基因的RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,获得了两个陆地棉纤维特异表达基因GhFLA1、GhAGP3的RNAi遗传转化再生植株。根据遗传转化过程中的特异现象及再生植株的非正常表型推测,AGPs基因参与了包括胚胎发生、膨胀以及分化等在内的多种细胞活动。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 棉花纤维发育的生理过程
• 1.2 棉花纤维发育的分子生物学研究进展
• 1.2.1 棉花纤维发育相关基因的克隆及功能分析
• 1.3 植物基因功能研究策略
• 1.4 RNA干扰技术简介
• 1.5 Gateway构建RNAi载体技术
• 1.6 RNAi载体pHELLSGATE
• 1.7 基因家族
• 1.7.1 基因家族的概念
• 1.7.2 研究基因家族的价值
• 1.7.3 基因家族研究的几点策略
• 1.7.4 基因家族研究需解决的问题
• 1.8 GhAGP3和GhFLA1的研究背景
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 基因来源
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 菌株和载体
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 缓冲液和培养基配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组DNA抽提
• 2.2.2 RNA提取及纯化
• 2.2.3 Northern杂交
• 2.2.4 RT-PCR分析
• 2.2.5 生物信息学分析
• 2.2.6 载体构建
• 2.2.7 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化
• 2.2.8 再生过程的细胞观察
• 2.2.9 再生植株的快速PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 序列与表达分析
• 3.1.1 GhAGP3和GhFLA1的序列信息及分析
• 3.1.2 同源性分析结果
• 3.1.3 保守结构域分析
• 3.1.4 GPI锚定预测
• 3.1.5 预测蛋白序列的进化树分析
• 3.1.6 表达特征分析
• 3.2 载体构建的检测结果
• 3.3 转基因结果分析
• 3.3.1 转基因再生植株的获得
• 3.3.2 再生过程的细胞观察结果
• 3.3.3 PCR检测结果
• 4 讨论
• 4.1 两种棉花AGPs基因的表达多样性及功能的初步推测
• 4.2 RNAi载体靶片段的选择
• 4.3 RNAi off-target效应及靶向特异性分析
• 4.4 载体构建的几点注意问题
• 4.5 遗传转化中的特异现象及再生植株的非正常表型
• 参考文献
• 致谢