猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的一种急性、发热性、高度接触性的病毒性传染病。其在世界范围内流行并引起巨大的经济损失,发病率高,死亡率高,严重威胁着养猪业。我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗,在我国乃至全球得到广泛应用,为猪瘟的防控做出了巨大贡献。猪瘟兔化弱毒疫苗包括组织苗和细胞苗,然而不同厂家之间生产的疫苗的免疫效价以及产生的免疫效果均不一样。为了对猪瘟兔化病毒含量进行准确测定,本研究通过RT-PCR方法和体外转录方法,构建了体外转录RNA作为标准品;并通过对各种反应条件和反应体系进行优化,建立了一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法。同时,利用该方法对3个不同厂家生产的猪瘟兔化弱毒疫苗进行了猪瘟兔化弱毒含量的测定,以及猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中不同增殖情况的测定。本研究获得以下结果:（1）参照GenBank中公布的猪瘟兔化弱毒全长序列（登录号为AF091507）,在其5′端非翻译区设计一对引物,通过RT-PCR成功得到与预期大小相符且包含有T7启动子序列的DNA片段,回收纯化后在T7 RNA聚合酶作用下通过体外转录成功构建了猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的RNA标准品。其纯度高,稳定性好,浓度高,一次体外转录得到的RNA标准品保存在-70℃下可供长期使用。（2）通过对退火温度、引物和探针浓度等反应条件和反应体系的优化,成功建立了能准确定量猪瘟兔化弱毒的一步法荧光定量PCR检测方法。该方法对猪瘟病毒有很好的特异性,检测灵敏度可达10拷贝/μL RNA,比RT-nPCR方法高出一个数量级,在较广的范围内（1.0×108～1.0×102拷贝/μL）具有很好的相关性（R2=0.999）。对高、中、低3种浓度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%、0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%、1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。（3）对不同厂家生产的不同类型疫苗进行猪瘟兔化弱毒含量测定表明:同一厂家中每一头份脾淋苗中包含的病毒含量比细胞苗中要高出约1～2个数量级,而从不同厂家对比中可以看出,其生产的脾淋苗和细胞苗之间病毒含量有所差异,其中脾淋苗最高相差20.8倍,细胞苗最高相差30.3倍,但所检测疫苗都达到兔体定型热反应要求。（4）对猪瘟兔化病毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中增殖情况进行了初步测定,结果显示猪瘟兔化病毒在前者中含量高出在后者中7.1倍,为进一步探索猪瘟病毒在细胞中的增殖提供了有效的检测手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展
• 1.1 猪瘟概述
• 1.2 猪瘟病毒概述
• 1.3 猪瘟诊断方法的研究进展
• 1.3.1 免疫荧光试验
• 1.3.2 免疫组化试验
• 1.3.3 RT-PCR 方法检测猪瘟
• 1.3.4 RT-nPCR 方法检测猪瘟
• 1.3.5 Real time RT-PCR 方法检测猪瘟
• 第二章 荧光定量PCR 技术及其研究进展
• 2.1 荧光定量PCR 技术概述
• 2.2 荧光定量PCR 技术在各个研究领域的研究进展
• 2.2.1 荧光定量PCR 技术在传染病诊断和病原体定量上的应用
• 2.2.2 荧光定量PCR 技术在基因表达研究中的应用
• 2.2.3 荧光定量PCR 技术在人类肿瘤研究上的应用
• 2.2.4 荧光定量PCR 技术在动物疾病诊断上的应用
• 2.2.5 荧光定量PCR 技术在转基因产品检测中的应用
• 2.2.6 荧光定量PCR 技术在疫苗效力检定上的应用前景
• 2.3 展望
• 试验研究
• 第三章 猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR 检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞株与病毒株
• 3.1.2 主要试剂和溶液配制
• 3.1.3 主要仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物和探针的设计与合成
• 3.2.2 标准品体外转录RNA 的制备
• 3.2.3 荧光定量PCR 方法的建立
• 3.3 结果
• 3.3.1 提取的猪瘟病毒总RNA 完整性的鉴定
• 3.3.2 标准品引物的扩增及其测序
• 3.3.3 标准品RNA 纯度及质量检测
• 3.3.4 退火温度的优化
• 3.3.5 引物和探针浓度的优化
• 3.3.6 标准曲线及灵敏性试验
• 3.3.7 特异性试验
• 3.3.8 准确性和重复性试验
• 3.3.9 与RT-nPCR 方法的比较
• 3.4 讨论
• 3.4.1 荧光定量PCR 方法对猪瘟病毒的检测
• 3.4.2 荧光定量PCR 方法中标准品的选择
• 3.4.3 一步法荧光定量PCR 方法的优劣
• 3.5 小结
• 第四章 猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR 检测方法的初步应用
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞株与病毒株
• 4.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗
• 4.1.3 主要试剂和溶液配制
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的测定
• 4.2.2 原代牛睾丸细胞的培养
• 4.2.3 猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中增殖含量的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的测定
• 4.3.2 猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中的增殖情况
• 4.4 讨论
• 4.4.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量的分析
• 4.4.2 不同细胞中猪瘟兔化弱毒增殖情况的分析
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介