胰腺组织糖蛋白组学研究中总蛋白样品制备方法的研究及在胰腺肿瘤标志物筛选中的初步应用

论文摘要

蛋白质组学是生命科学中继基因组计划之后最为活跃的热点研究领域,蛋白质组学研究的关键在于蛋白质的分离和鉴定。二维凝胶电泳（2-DE）是目前应用最为广泛的蛋白质组学分离技术,但其存在着诸多难以克服的缺陷;多维液相色谱以其分离率高,方法灵活多样,且容易实现自动化等特点,受到越来越多的研究者的重视,在蛋白质组学研究中逐渐扩大了应用范围。但是,蛋白质组学研究相关技术体系建立时间短,目前仍存在许多待改进之处,尤其在组织蛋白样品制备方面,尚没有一种较好的方法适用于胰腺组织样品制备,常用的组织总蛋白提取方法对于提取胰腺组织总蛋白效果不理想。本研究对比不同胰腺组织总蛋白提取方法,测定其提取液中总蛋白含量,并利用离线多维液相色谱联用进行初步分离,最后对各分离组分用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MADLI-TOFMS）进行检测,从中筛选出胰腺组织总蛋白最佳提取方法,并将其应用于胰腺癌肿瘤标志物的初步筛选中。实验一胰腺组织匀浆化方法的建立目的：探讨不同组织匀浆化方法提取胰腺组织总蛋白效率，寻找最佳胰腺组织匀浆化方法，为后续胰腺组织蛋白质组学研究提供基础。方法：取健康成年SD大鼠胰腺组织，采用不同方法匀浆化组织，用总蛋白提取试剂盒提取胰腺组织总蛋白；Bradford法测定提取液总蛋白浓度；使用SECRPLC分离并用MALDI-TOF MS检测。结果：从0.1g胰腺组织中分别用液氮研磨配合反复冻融法和液氮研磨配合超声破碎法总蛋白提取量分别为：（6.7±0.5） mg、（6.9±0.2）mg，分别检测出（304.2±22.3）、（331.6±30.5）种不同质荷比蛋白/多肽分子；机械匀浆配合反复冻融法和机械匀浆配合超声破碎法总蛋白提取量分别为（5.4±0.2） mg、（5.6±0.2）mg，分别检测出（263.6±19.7）、（289.8±12.2）种不同质荷比蛋白/多肽分子。结论：液氮研磨配合超声破碎法可以较好匀浆化胰腺组织而没有改变组织化学性质，有利于下一步研究。实验二胰腺组织总蛋白提取方法的研究目的：通过对比提取胰腺组织总蛋白不同方法，建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法。方法：取健康成年SD大鼠胰腺组织，采用常规的总蛋白一步提取法、分步提取法和不同pH值裂解液提取法，分别提取胰腺组织总蛋白，测定总蛋白浓度并分别经SEC- RPLC分离后用MALDI-TOF MS检测。结果：从0.3g胰腺组织中分别用一步法、分步法和不同pH值裂解液提取法提取总蛋白量分别为（18.7±2.8） mg、（23.2±1.0） mg和（18.3±0.3） mg，MALDI-TOF MS检测出不同质荷比蛋白/多肽数分别为（404±37.4）、（447.8±23.3）和（399.8±43.6）个。分步法和不同pH值裂解液提取法分别得到特异性质荷比蛋白/多肽数为31个和14个。结论：分步法与常规的一步法相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点；不同pH值裂解液提取法可提取更多酸性蛋白。实验三胰腺肿瘤特异性糖蛋白/多肽的初步筛选目的：通过对胰腺癌组织总蛋白样品的检测，筛选出差异糖蛋白/多肽分子，并初步探讨其表达与胰腺肿瘤组织类型的关系。方法：用实验二的分步法提取胰腺癌组织总蛋白，用AFC- RPLC分离并用MALDI-TOF MS检测6例胰腺癌组织中分子量为5733D糖蛋白/多肽表达情况。结果：在6例胰腺癌组织中，有3例检测出5733D的糖蛋白/多肽阳性表达，阳性表达检出率为50%。结论：5733D糖蛋白/多肽在胰腺癌组织中的表达可能与胰腺癌的发生和恶性程度有关,有望成为胰腺癌诊断的新的肿瘤标志物。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 引言
• 实验一：胰腺组织匀浆化方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二：胰腺组织总蛋白提取方法的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三：胰腺肿瘤特异性糖蛋白/多肽的初步筛选
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历和研究成果
• 致谢