旋毛虫肌幼虫冷冻耐力与同工酶分析及成囊前幼虫感染性的研究

论文摘要

旋毛虫病（trichinellosis）是一种严重的人兽共患寄生虫病。目前全世界大约有1100万人体感染者,现已被列入再度肆虐的疾病（re-emerging disease）。由于旋毛虫属不同种的地理分布、宿主范围、冰冻耐力、对宿主的感染性与致病性及宿主对不同虫种的免疫应答等方面存在有明显差异,故旋毛虫属分类的研究对旋毛虫病的病原学、免疫学、流行病学、临床学及预防等均有重要意义。目前国际旋毛虫病委员会推荐应用的肉类中旋毛虫检疫的方法是消化法,我国国家标准“猪旋毛虫病诊断技术”规定对屠宰猪肉中的旋毛虫检疫方法亦是消化法。一般认为旋毛虫感染宿主后约1个月在幼虫周围形成囊包,但成囊前期幼虫对新宿主是否具有感染性以及能否用消化法进行检疫,目前尚不清楚。本文对我国旋毛虫不同地理株的冷冻耐力与同工酶进行了分析,并对旋毛虫成囊前期幼虫的感染性及消化后的存活情况进行了观察。材料与方法1.旋毛虫虫种与地理株本实验所用虫种为旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（T2）、布氏旋毛虫（T3）、伪旋毛虫（T4）及纳氏旋毛虫（T7）;6个猪源旋毛虫地理株来自湖北、天津、哈尔滨、同江、云南（大理）及河南（南阳）。2.实验动物与肌幼虫收集4周龄健康雄性昆明小鼠,每只体重18g～20g,购自郑州大学医学院实验动物中心。将不同种和地理株旋毛虫感染小鼠后42天拉颈处死,全身肌肉人工消化后收集纯净的旋毛虫肌幼虫。3.冷冻耐力试验将60只小鼠随机分成3组,每组20只。将分别感染T2、河南株与云南株肌幼虫的小鼠在感染后42天剖杀,制备肉样,每份重约5克,约50mm×6mm×6mm,置于5ml EP管中-18℃分别保存6h、12h、24h、48h。肉样室温解冻后压片镜检,每组小鼠感染300条冰冻保存不同时间的幼虫。另取10只小鼠分为2组作为对照组,分别感染T2与河南株的正常肌幼虫。所有感染小鼠均在感染后42天后剖杀,全身肌肉消化后贝氏法收集肌幼虫,计算生殖力指数（reproductive capacity index,RCI）,观察T2、河南株与云南株肌幼虫的冷冻耐力。生殖力指数（RCI）=实验动物感染后42天回收的肌幼虫数/接种的肌幼虫数。4.同工酶试验将旋毛虫不同种与地理株的纯净肌幼虫加酶稳定剂后制备匀浆,离心后取上清作为粗酶液。将粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,染色,用GeneGenius凝胶图像分析仪对酶谱进行分析。5.小鼠感染旋毛虫后14-21天3种方法的检测将80只小鼠随机分成8组（每组10只）,每组感染旋毛虫河南株肌幼虫300条,感染后14-21天每天采血后剖杀1组,分别用镜检法（膈肌压片）与贝氏法（小鼠肌肉剪碎）观察成囊前期幼虫的检出率;用ELISA检测小鼠血清抗体水平。6.不同日龄成囊前期幼虫对小鼠感染性的观察①将感染旋毛虫后14～21天的小鼠膈肌（即含8～15日龄的成囊前期幼虫）压片镜检,将含幼虫的膈肌喂饲小鼠,42天后剖杀,肌肉消化后观察收集的幼虫数。②将贝氏法收集的8～15日龄成囊前期幼虫灌胃感染小鼠（每只300条）,42天后剖杀,肌肉消化后观察收集的幼虫数。③另取10只小鼠作为对照,每只经口感染300条成囊期（肌）幼虫,42天后剖杀,肌肉消化后观察收集的幼虫数。7.小鼠感染旋毛虫后不同时间血清抗体水平观察将12只健康昆明小鼠每只经口感染300条旋毛虫肌幼虫,感染后11-28天ELISA观察血清抗体水平的变化。结果1.冷冻耐力试验含有旋毛虫河南株、云南株和T2肌幼虫的小鼠肉样-18℃保存不同时间后感染小鼠,河南株-18℃保存6h及12h后的RCI分别为0.03和0;云南株-18℃保存6h、12h及24h后的RCI分别为0.04、0.01和0;T2-18℃保存6h、12h、24h、48h后的RCI分别为26.8、21.9、10.8和7。经方差分析,T2的RCI总体差异显著（F=6.763,P＜0.05）,在6h与12h以及24与48h之间的差异无显著性（P＞0.05）,但在12h与24h之间差异有显著性（P＜0.05）,提示T2肌幼虫-18℃保存12h后感染性有明显下降。2.同工酶试验超氧化物岐化酶在6个地理株的酶带迁移率与T1和T4相同,与T2、T3及T7明显不同;苹果酸酶的酶带迁移率在黑龙江株和同江株与其他4个地理株稍有不同,6个地理株与T3均明显不同;酯酶的酶带迁移率在6个地理株与5种旋毛虫之间无明显差别;谷氨酸脱氢酶的酶带迁移率在6个地理株与T4、T7明显不同,与其他虫种无明显差异。3.小鼠感染旋毛虫14～21天3种方法的检测结果小鼠感染旋毛虫后14、15天,镜检法对成囊前期幼虫的检出率分别为50%（4/8）和89%（8/9）,感染后16～21天检出率均为100%;感染后14～21天,贝氏法的检出率均为100%;感染后14～21天,ELISA检测的小鼠血清抗体阳性率分别为12.5%（1/8）、11.1%（1/9）、11.1%（1/9）、25%（2/8）、22.2%（2/9）、22.2%（2/9）、40%（4/10）及40%（4/10）。感染后14天镜检法和贝氏法对成囊前期幼虫的检出率有显著性差异（X2=5.333,P＜0.05）;感染后15天两者的检出率无显著性差异（9/9）（X2=1.059,P＞0.05）。旋毛虫感染后18天及21天,ELISA的阳性率均明显低于镜检法和贝氏法（X2=18.9,P＜0.05;X2=18.9,P＜0.05）。4.不同日龄成囊前期幼虫对小鼠的感染性8～11日龄成囊前期幼虫经喂饲膈肌和灌胃接种小鼠后42天,剖杀小鼠全身肌肉消化后均未检获幼虫,表明11日龄之前的幼虫无感染性。含12～15日龄幼虫膈肌分别喂饲9、9、10、10只小鼠,42天后小鼠的感染成功率均为100%,每只小鼠平均检获幼虫数分别为101.38±110.45、367.43±728.32、15448.67±6178.35及27433.30±11733.24;12～15日龄幼虫分别灌胃接种10只小鼠,42天后小鼠的感染成功率分别为33%（3/10）、33%（3/10）、40%（4/10）及40%（4/10）,检获的幼虫数分别为5、6、12及92条。12、13日龄幼虫喂饲膈肌和灌胃2种方法的感染成功率之间有显著性差异（X2=9.975,P＜0.05）,14、15日龄两种感染方法阳性率亦有显著差异（X2=10.769,P＜0.05）。结果表明12日龄幼虫开始具有感染性,且幼虫日龄与喂饲膈肌感染小鼠后检获的虫数呈相关性（r=0.939,P＜0.05）,幼虫日龄与灌胃接种小鼠后的感染成功率亦呈相关性（r=0.926,P＜0.05）,表明旋毛虫成囊前期幼虫的感染性随着日龄延长而增加。含11～13日龄幼虫的小鼠肌肉消化30min的幼虫存活率分别为6.9%（16/231）、54.6%（136/249）及67.2%（199/296）,60min的幼虫存活率分别为43.4%（148/341）、57.3%（142/248）及89.6%（267/298）,240min的幼虫存活率分别为6.4%（20/314）、25.1%（77/307）、58.1%（462/795）。含11～13日龄幼虫的小鼠肌肉消化30、60及240min的幼虫存活率之间均有显著性差异(X230min=203.50,X260min=149.78,X2240min=286.24,P＜0.05)。表明肌肉消化后幼虫的存活率随幼虫日龄的延长而增加。5.小鼠感染旋毛虫后不同时间血清抗体水平观察小鼠感染旋毛虫后11天开始检出血清抗体,阳性率为8%（1/12）,此后抗体阳性率逐渐增高,至感染后24天阳性率达100%;感染后11～28天的血清吸光度（A492）之间有显著性差异（F=10.731,P＜0.05）。结论1.旋毛虫河南株和云南株肌幼虫对冰冻的抵抗力较弱,两者经-18℃分别保存12h和24h已无感染性。乡土旋毛虫肌幼虫对冰冻抵抗力较强,经-18℃保存48h仍有感染性。2.我国6个旋毛虫地理株的4种同工酶酶谱相似,均与旋毛虫国际参考株的酶谱一致。3.旋毛虫感染小鼠后18天的成囊前期幼虫（12日龄）开始具有感染性,感染性随幼虫日龄的延长而增加;对旋毛虫感染动物后的早期检疫贝氏法优于镜检法与ELISA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 旋毛虫病的简介
• 1.2 旋毛虫属的分类
• 1.3 旋毛虫的冷冻耐力及同工酶分析
• 1.4 旋毛虫成囊前期幼虫的感染性
• 1.5 研究的目的、内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验动物
• 2.4 旋毛虫虫株
• 2.5 旋毛虫感染动物
• 2.6 消化液的配制
• 2.7 旋毛虫肌幼虫的收集
• 2.8 冷冻耐力试验
• 2.9 同工酶实验
• 2.10 旋毛虫成囊前幼虫感染性研究
• 2.11 统计学分析方法
• 3 结果
• 3.1 冷冻耐力试验结果
• 3.2 同工酶实验结果
• 3.3 旋毛虫成囊前幼虫感染性研究结果
• 4 讨论
• 4.1 旋毛虫肌幼虫的冷冻耐力
• 4.2 同工酶试验
• 4.3 旋毛虫成囊前期幼虫的感染性
• 5 结论
• 参考文献
• 综述:同工酶技术在旋毛虫属分类研究中的应用及其主要影响因素
• 参考文献
• 英文缩写词索引
• 致谢