拟南芥AT-hook蛋白的功能研究

论文摘要

CRY1和CRY2是拟南芥的两个蓝光受体,参与植物的许多发育过程,如开花时间和下胚轴的伸长。本研究在拟南芥隐花色素cry1cry2双突变体背景下,通过激活标签的方法,筛选到两个晚开花的突变体。对其基因型分析发现,这两个突变体的晚开花表型分别是由AT-hook基因AHL22和AHL27的过量表达所引起,这表明AT-hook基因参与植物开花时间的调节。本研究克隆了AHL22和AHL27基因以及与这两个基因高度同源的AHL18和AHL29基因。通过生物信息学分析发现,这些基因所编码的AT-hook蛋白含有一个AT-hook基序和一个PPC结构域。在拟南芥野生型中分别过量表达这些基因,其转基因植株在长日照和短日照条件下都表现为开花延迟;其下胚轴在不同的光质和光强下都变短;并且,AHL22过量表达会抑制主根的生长。进一步通过对单突变、双突变和四突变体的分析发现,当AHL18,AHL22,AHL27和AHL29四个基因的表达同时下调后,四突变体表现为早开花和下胚轴伸长的表型,显示了这四个AT-hook基因对开花时间的调节和在光形态建成中的作用。对AHL22和AHL27过量表达植株和RNAi四突变体中开花基因和下胚轴相关基因的mRNA表达分析,表明AHL22延迟开花主要是抑制了开花基因CO和FT的表达,AHL27过量表达的晚开花表型是FT和FLC的mRNA表达水平变化共同作用的结果,AHL18,AHL22,AHL27和AHL29抑制下胚轴伸长主要是由于PIF4基因表达水平下调的结果。对这四个AT-hook基因在不同器官中的mRNA表达和启动子活性分析发现,它们主要表达在根和花中,基因表达具有明显的组织特异性。凝胶迁移滞后实验表明AHL22和AHL27蛋白能够结合富含AT碱基的DNA序列,证明了AT-hook蛋白与DNA的结合特性。同时,亚细胞定位分析结果显示这四个AT-hook蛋白都是核定位蛋白。通过本文的研究发现,四个核定位的AT-hook蛋白AHL18,AHL22,AHL27和AHL29共同参与拟南芥开花和下胚轴生长的调节,它们在拟南芥的生长发育中起着重要的调控作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 AT-HOOK蛋白的研究进展
• 1.2 拟南芥的基本特性
• 1.3 拟南芥开花调控途径
• 1.3.1 光周期途径
• 1.3.2 春化途径
• 1.3.3 自主途径
• 1.3.4 赤霉素途径
• 1.4 拟南芥下胚轴生长的调控
• 1.5 本研究的研究内容和策略
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 主要的分子生物学试剂和实验仪器
• 2.2 植物材料的种植和培养
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 载体的构建
• 2.3.2 PCR产物的回收和连接反应
• 2.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.4 连接产物的转化
• 2.3.5 克隆鉴定、质粒提取和测序
• 2.3.6 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.7 农杆菌的转化及阳性克隆的鉴定
• 2.3.8 拟南芥的转化
• 2.3.9 DNA的提取
• 2.3.10 Trizol法提取RNA及纯化
• 2.3.11 cDNA第一链的合成
• 2.3.12 基因组和质粒PCR
• 2.3.13 半定量RT-PCR
• 2.3.14 实时荧光定量PCR
• 2.3.15 突变体的筛选与鉴定
• 2.3.16 转基因植株及突变体开花时间的表型分析
• 2.3.17 转基因植株及突变体下胚轴的表型分析
• 2.3.18 转基因植株根的表型分析
• 2.3.19 叶绿体的测定
• 2.3.20 化学组织染色
• 2.3.21 融合蛋白的表达纯化和抗体制备
• 2.3.22 SDS-PAGE电泳和蛋白杂交
• 2.3.23 植物总蛋白的提取
• 2.3.24 植物核蛋白的提取
• 2.3.25 蛋白的亚细胞定位
• 2.3.26 凝胶迁移滞后实验
• 2.3.27 本研究所应用的引物序列
• 第三章 结果与分析
• 3.1 生物信息学分析
• 3.1.1 进化树分析
• 3.1.2 氨基酸的序列比对
• 3.2 突变体的筛选与鉴定
• 3.3 AT-HOOK蛋白对拟南芥开花时间的调控
• 3.3.1 AHL22基因过量表达植物的晚开花表型
• 3.3.2 AHL18基因过量表达延迟拟南芥开花
• 3.3.3 AHL27和AHL29基因过量表达延迟拟南芥的开花时间
• 3.3.4 突变体和RNAi植株的开花表型
• 3.4 AT-HOOK基因对下胚轴伸长的抑制
• 3.4.1 AHL22抑制下胚轴的伸长
• 3.4.2 AHL22过表达植株中光受体和下胚轴相关基因的表达
• 3.4.3 AHL18,AHL27和AHL29抑制下胚轴的伸长
• 3.4.4 双突变体和四突变体下胚轴的伸长
• 3.5 AHL22抑制主根的生长
• 3.6 AT-HOOK基因过表达对植株叶和花形态的影响
• 3.7 AT-HOOK基因的表达模式
• 3.7.1 利用生物信息学预测AT-hook基因在不同组织器官的表达模式
• 3.7.2 GUS组织化学染色及mRNA表达水平的检测
• 3.7.2.1 AHL22基因的GUS组织化学染色和mRNA表达水平的检测
• 3.7.2.2 AHL22在不同发育时期的表达模式
• 3.7.2.3 AHL27基因的启动子活性分析
• 3.8 AHL22和AHL27抗原抗体的制备
• 3.9 AT-HOOK蛋白的亚细胞定位
• 3.9.1 AHL22蛋白定位于细胞核
• 3.9.2 AHL27蛋白定位于细胞核
• 3.9.3 AHL18和AHL29蛋白定位于细胞核
• 3.10 AHL22和AHL27蛋白与富含AT碱基DNA序列的特异结合
• 第四章 讨论
• 4.1 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29是高度保守的AT-HOOK核定位蛋白
• 4.2 AT-HOOK基因的组织特异性表达决定它的功能
• 4.3 AT-HOOK蛋白对植物发育调控的功能多样性
• 4.4 AT-HOOK蛋白与目的基因的结合和调控作用
• 第五章 全文结论
• 5.1 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29四个蛋白有高度的序列相似性
• 5.2 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29四个基因主要表达在根和花中
• 5.3 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29四个蛋白为核定位蛋白
• 5.4 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29调控拟南芥开花
• 5.5 AHL18,AHL22,AHL27,AHL29抑制下胚轴的伸长
• 5.6 AHL22抑制主根的生长
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历