草鱼纤维素分解菌筛选、酶提纯及其相关活性研究

论文摘要

纤维素主要存在于植物的细胞壁中,是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的可再生资源。由于纤维素分子是以β-1,4糖苷键相连接而形成的直链多糖,在自然状况下难以降解成可以利用的二糖或单糖等短链低聚糖,利用微生物产生的纤维素酶将其转化为人类可以直接利用的物质,解决急需的能源、食物和化工原料等,是科学界长期研究的课题之一,这对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机等具有重大的现实意义。研究表明,自然界中许多陆生真菌和细菌能够产纤维素酶。真菌产生的纤维素酶类通常为酸性酶,最适PH在3-5之间,在碱性范围内无活性或活性很低,且多数靠固态发酵来产纤维素酶,这使得真菌纤维素酶的应用和产量受到一定的限制;细菌所产生的纤维素酶一般适应中性至偏碱性环境,由于相应的酶对天然纤维素的水解作用较弱,长期以来其开发利用没有得到足够的重视,近年,随着中性和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶已显示出良好的使用性能和经济价值。细菌具有结构简单、繁殖快等特点,是基因工程的主要材料,其液态深层发酵具有条件容易控制,不易染杂菌,生产效率高等优势,使得从细菌中提取纤细素酶将可能以其高效性而成为一个重要的途径。目前报道的产纤维素酶细菌主要为产芽孢梭菌（Clostridum SP）、类似黄链霉菌（Xanthomonas）、嗜酸纤维素分解菌（Acidothermus Cellulolyticus）等,这些菌株大多为陆生菌株。从水体特别是从水生动物体内筛选的能产纤维素酶的细菌菌株报道甚少。自然条件下,水生植物是草食性鱼类的主要食物来源,从生理适应性的角度推断,此类鱼可能具有纤维素的分解能力,从其他陆生食草动物的研究成果来分析,这种分解能力应来自于肠道中的纤维素分解菌。常见的草食性鱼类有草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鳊（Parabramis pekinensis）、鲂（Megalobramaamblycephala）等,其中生长速度最快,食草量最大的是草鱼。本课题以草鱼为对象,就草食性鱼类肠道纤维素分解菌进行了相关研究。实验中,利用刚果红选择平板法,从草鱼肠道内筛选出四株能产纤维素酶,并具有较高酶活性的细菌菌株,分别测定了各菌株的内切β—葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和滤纸酶的活力。从细菌形态、生理生化和16S rRNA层面上对纤维素分解菌进行了分类鉴定,结果为阿斯布肠道杆菌（Enterobacter asburiae）和枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。对其中X7菌株的液态发酵产酶条件进行了研究,初步确定产酶的最适培养条件为:初始PH值为7.0-7.3,接种量为5%（v/v）,培养温度为37℃;最适培养基为:羧甲基纤维素钠（CMC-Na）1%（w/v）,蛋白胨1%（w/v）,KH2PO40.1%（w/v）,NaCL0.5%（w/v）。在最适条件下,液态培养菌株,通过超声波破碎细胞壁、磁力搅拌菌体、离心过滤菌体等方法处理发酵液,检测并比较纤维素酶的活性,认为该菌株所产的酶为胞外酶。利用盐析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析,Sephadex G-75凝胶过滤,经过SDS-聚丙烯酰胺电泳检验,初步判定该酶为多亚基结构。对纯化后的纤维素酶的酶学性质进行了研究。以羧甲基纤维素作为底物时,该菌株所产纤维素酶的最适宜的催化温度为55℃,酶反应的温度范围较宽,在45℃-65℃的温度范围内,热稳定性良好,在80℃条件下仍残存有30%的酶活。最适宜的PH值为7.0,在4.0-7.0之间的PH值范围内,酶的活力较稳定。Mn2+、Mg2+对酶的活性有激活作用;Fe2+、Ca2+、Zn2+对酶的活性有抑制作用;Cu2+、Co2+有明显的毒害作用。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物的Km值为5.3×10-3g/ml。为了解药物对纤维素酶产生菌的生长和活性影响,以指导渔用药物的使用,进行了相应菌株的药物试验。抑菌实验表明:四种菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等药物高度敏感,对磺胺二甲嘧啶和土霉素相对不敏感。MIC和MBC的实验表明:氟苯尼考、诺氟沙星对四种菌的纤维素酶活性有较强的抑制作用;土霉素的抑制影响相对较弱;磺胺二甲嘧啶无明显影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 细胞壁结构与主要成分
• 2.1 细胞壁结构
• 2.2 细胞壁主要成分
• 3 纤维素
• 3.1 纤维素的分子结构
• 3.2 纤维素的性质
• 3.3 纤维素的降解
• 3.4 纤维素细菌
• 3.5 用于研究纤维素水解的纤维素材料
• 4 纤维素酶
• 4.1 纤维素酶的组成与分类
• 4.2 纤维素酶的分子结构
• 4.3 纤维素酶的催化作用机制
• 4.4 纤维素酶的理化性质
• 5 产纤维素酶的微生物
• 6 纤维素酶的分离纯化
• 7 纤维素酶的研究进展
• 7.1 国外研究概况
• 7.2 国内研究概况
• 7.3 水产类微生物纤维素酶的研究现状
• 8 纤维素酶的应用
• 8.1 在食品加工和酿造工业上的应用
• 8.2 在饲料工业上的应用
• 8.3 在纺织工业上的应用
• 8.4 在能源工业中的应用
• 8.5 在环境保护和处理纤维素废料中的应用
• 8.6 纤维素酶在医药工业中的应用
• 8.7 在烟草加工中的应用
• 9 纤维素酶在实际运用中的意义及问题
• 10 细菌的鉴定
• 11.酶的分离纯化
• 12 本课题研究的主要内容及技术路线
• 12.1 本课题研究的思路及意义
• 12.2 技术路线
• 第二章 草鱼肠道内产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
• 1.前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 培养基
• 2.3 主要试剂及实验仪器
• 2.4 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株的初筛
• 3.2 菌种的复筛
• 3.3 不同碳源对产酶的影响
• 3.4 不同氮源对产酶的影响
• 3.5 培养温度对产酶的影响
• 3.6 培养基的初始PH值对产酶的影响
• 3.7 发酵时间对产酶的影响
• 3.8 种子培养时间对产酶的影响
• 3.9 接种量对产酶的影响
• 4 讨论
• 4.1 纤维素酶活性的测定
• 4.2 底物及酶液本身含糖量对结果的影响
• 4.3 产纤维素酶菌株的筛选
• 4.4 产酶条件的确定
• 第三章 草鱼肠道纤维素分解菌的分类鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 试剂
• 2.4 染剂
• 2.5 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 菌落的形态特征
• 3.2 细菌的形态特征
• 3.3 细菌的生理生化特征
• 3.4 细菌DNA提取
• 3.5 细菌16S rRNA基因序列扩增
• 3.6 细菌pMD18-T-16SrRNA克隆载体的鉴定
• 4 讨论
• 第四章 纤维素酶的分离纯化及其酶学性质的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白质标准曲线的绘制
• 2.2.2 蛋白质浓度的测定
• 2.2.3 粗酶液的的制备
• 2.2.4 纤维素酶的细胞定位
• 2.2.5 硫酸铵分级盐析初步提取纤维素酶
• 2.2.6 透析脱盐
• 2.2.7 DEAE-Sephadex A-50离子交换层析
• 2.2.8 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析
• 2.2.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.10 反应温度对纤维素酶活力的影响和酶的热稳定性
• 2.2.11 酶反应的最适PH值及酶的PH值稳定性
• 2.2.12 纤维素酶Km的测定
• 2.2.13 不同金属化合物对酶活力的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 蛋白质标准曲线
• 3.2 纤维素酶的细胞定位
• 3.3 硫酸铵的分级沉淀
• 3.4 DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析结果
• 3.5 Sephadex G-75凝胶过滤
• 3.6 酶的纯度鉴定
• 3.7 纤维素酶的分离纯化结果
• 3.8 反应温度对纤维素酶活力的影响和酶的热稳定性
• 3.9 酶反应的最适PH值及PH稳定性
• 3.10 纤维素酶Km的测定结果
• 3.11 不同金属化合物对酶活力的影响
• 4 讨论
• 4.1 纤维素酶的细胞定位
• 4.2 纤维素酶的分离纯化
• 4.3 纤维素酶的SDS-PAGE
• 4.4 酶学特性的研究
• 4.5 金属化合物的酶活力影响
• 第五章 草鱼肠道纤维素分解菌药敏实验
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 纸片扩散法
• 3.2 MIC和MBC
• 3.3 酶活性测定
• 4.讨论
• 第六章 基本结论和创新点
• 1 基本结论
• 2 本课题的主要创新点
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢