重组杆状病毒表达SVCV G蛋白及其转导鱼类细胞的研究

论文摘要

鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）属于弹状病毒科水泡性病毒属中的一员,该病毒可引起鲤鱼爆发鲤春病毒血症（Spring Viremia of Carp,SVC）。囊膜糖蛋白（G）是SVCV最主要的免疫原性蛋白,是疫苗和诊断试剂研制的重要靶蛋白。本研究将连有SVCV G蛋白（SVCV/G）基因的重组转移质粒pFastBac-SVCV/G转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-SVCV/G。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Bac-SVCV/G。结果发现SVCV/G可介导昆虫细胞发生融合,通过间接免疫荧光证明,SVCV/G蛋白表达在昆虫细胞膜上。前人研究发现,水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）的G蛋白（VSV/G）同样可以表达在昆虫细胞膜上并可介导昆虫细胞融合。为比较SVCV/G与VSV/G介导的细胞融合,以及便于杆状病毒滴度的测定,本研究构建了三个重组杆状病毒Bac-SVCV/G-CMV-EGFP、Bac-VSV/G-CMV-EGFP、Bac-CMV-EGFP,并用间接免疫荧光和Western blot检测了SVCV/G的表达。通过比较SVCV/G与VSV/G介导的昆虫细胞融合,证实了SVCV/G可介导更加显著的细胞融合。杆状病毒能高效转导哺乳动物细胞,现已成为一种新型的基因导入载体。本研究利用含有巨细胞病毒极早期基因（Cytomegalovirus immediate-early, CMV-IE）启动子及其下游增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的重组杆状病毒Bac-CMV-EGFP,分别转导了6种鱼类细胞系,并利用流式细胞仪检测了重组杆状病毒对鱼类细胞系的转导效率。研究发现,该重组杆状病毒可以高效转导鱼类细胞,特别是鲤鱼上皮瘤（EPC）细胞和胖头鲤肌肉（FHM）细胞,转导效率几乎为100%,对大马哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）细胞的转导效率较高,其次是草鱼肾脏（CIK）细胞和斑点叉尾鲴卵巢（CCO）细胞,对虹鳟性腺（RTG-2）细胞的转导效率虽不高,但发现也可以被转导。同时,本研究还发现,报告基因在EPC细胞中的表达能够持续存在至少80天,说明杆状病毒转导EPC细胞后,不仅可以实现外源基因的高效导入,而且还可以使外源基因稳定、高量的表达。此外,本研究还发现以生长培养基作为杆状病毒孵育液比以PBS作为孵育液能够更有效的提高转导效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 鲤春病毒血症
• 1.2 SVC的流行特点
• 1.3 SVCV病原特性
• 1.3.1 SVCV的分类
• 1.3.2 SVCV的理化学特性
• 1.4 SVCV基因组结构与功能
• 1.5 SVCV的蛋白质
• 1.5.1 核蛋白
• 1.5.2 磷蛋白
• 1.5.3 基质蛋白
• 1.5.4 糖蛋白
• 1.5.5 病毒依赖性RNA聚合酶蛋白
• 1.6 SVCV的检测
• 1.6.1 免疫学检测方法
• 1.6.2 分子生物学检测方法
• 1.7 杆状病毒表达载体的研究进展
• 1.7.1 杆状病毒简介
• 1.7.2 杆状病毒表达系统的介绍
• 1.8 杆状病毒转导脊椎动物细胞的研究进展
• 1.9 重组杆状病毒载体的应用
• 1.9.1 疫苗的研究
• 1.9.2 基因功能研究
• 1.9.3 基因治疗
• 1.10 本研究的目的和意义
• 第2章 SVCV G蛋白在昆虫细胞中的表达及特性分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组转移质粒pFastBac-SVCV/G的酶切鉴定
• 2.3.2 重组子rBacmid-SVCV/G及rBacmid-WT的构建
• 2.3.3 重组杆状病毒的获得
• 2.3.4 表达产物的间接免疫荧光检测
• 2.3.5 重组杆状病毒Bac-CMV-EGFP,Bac-SVCV/G-CMV-EGFP，Bac-VSV/G-CMV-EGFP的构建及获得
• 2.3.6 SVCV/G在昆虫细胞中表达的检测
• 2.3.7 SVCV/G蛋白与VSV/G蛋白介导细胞融合的比较
• 2.4 讨论
• 第3章 重组杆状病毒高效转导鱼类细胞的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 鱼类细胞培养及重组杆状病毒
• 3.2.2 Bac-CMV-EGFP对鱼类细胞的转导
• 3.2.3 流式细胞仪检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 Bac-CMV-EGFP对6种鱼类细胞的转导
• 3.3.2 转导EPC细胞后,不同时间点EGFP的表达量
• 3.3.3 不同MOI对转导效率的影响
• 3.3.4 孵育时间对转导效率的影响
• 3.3.5 孵育液对转导效率的影响
• 3.3.6 EGFP在转导后的EPC和CIK细胞中持续的时间
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录