肥胖易感与肥胖抵抗大鼠的代谢组学与转录组学研究

论文摘要

肥胖是机体能量摄入大于消耗的一种慢性能量平衡失调的结果,表现为机体脂肪组织量过多或脂肪组织的比例过高。近几十年来,大量的研究集中在引发肥胖的遗传学机制,以及各种环境因素诱发肥胖的病理基础,并取得了积极的成果。肥胖易感（obesity-prone, OP）和肥胖抵抗（obesity-resistant, OR）现象是指同一种属实验动物在接受相同的饮食喂养后,动物之间出现的两种体重表型,即部分动物产生明显的肥胖,而另一些动物的体重增长比例相对较低。OP与OR这两种表型的产生是遗传和环境因素之间互作的结果。针对OP与OR大鼠的研究将会有助于进一步认识肥胖及其所诱发的代谢性异常发生的机制,为寻找肥胖发生规律及有效的防治措施提供实验依据。目前,未见采用代谢组学与转录组学对OP与OR大鼠之间的代谢与基因表达进行对比研究的报道。因此,本课题采用了代谢组学、转录组学与分子生物学方法对OP与OR大鼠之间的代谢与基因表达进行对比研究,主要实验内容和结果包括:⑴大鼠对高脂饮食喂养不同反应的药物代谢组学研究利用药物代谢组学（Pharmaco-metabonomics）方法,发现了大鼠高脂饮食喂养前的基础代谢表型存在差异,主要包括肠道菌群结构以及能量代谢上的差异等,这些基础代谢表型上的差异与大鼠对高脂饮食干预后体重差异相关。同时,在链尿佐菌素（STZ）诱导的大鼠糖尿病模型上进一步验证了药物代谢组学方法,并发现大鼠化学干预前的尿液代谢谱与其血糖升高水平相关。⑵肥胖易感与肥胖抵抗大鼠生化代谢特征的比较各种生化分析表明OP与OR大鼠在肝脏脂质代谢和胰岛素敏感性等方面表现出显著性差异。胰岛素耐受实验和胰岛素敏感指数（HOMA-IR）表明OP动物的胰岛素敏感性较OR动物下降,而OP大鼠血清中游离脂肪酸、酮体、肝脏总胆固醇和甘油三酯水平显著升高;但是,OP与OR大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和空腹血糖等的水平并无显著性差异;⑶肥胖易感与肥胖抵抗大鼠血清、尿液和肝脏组织提取物中代谢物的比较研究表明:①OP与OR大鼠的血清、尿液和肝组织提取物中多种氨基酸的含量存在显著差异,并以肝组织中的差异氨基酸数量为最多,包括各种生酮和生糖氨基酸水平在OP组的升高,说明氨基酸代谢的差异是两种体重表型大鼠之间存在的重要差异特征之一;②OP与OR动物肝脏和血清差异代谢物中包含多种饱和长链脂肪酸的升高如十四烷酸、十六烷酸、硬脂酸等和多不饱和脂肪酸的下降如亚油酸和花生四烯酸,说明两种体重表型动物的肝脏脂肪酸代谢存在明显差异;③长期高脂饮食喂养后,动物的尿液代谢物分析表明OP与OR动物体内的肠道菌群结构存在差异,这些菌群上的差别可能在动物体重增长的调节上产生影响;④与OR动物相比,OP动物尿液代谢物中儿茶酚胺类递质的代谢终产物如高香草酸、扁桃酸和4-羟基苯乙酸明显升高。同时,OP大鼠血清中三羧酸循环中间体柠檬酸、α-酮戊二酸和苹果酸等也显著高于OR大鼠,说明OP大鼠体内的交感神经系统活性及能量代谢过程更为活跃,可能与OP动物体内更多的能量需求有关。⑷肥胖易感与肥胖抵抗大鼠转录组学比较发现两组动物肝脏中有近80种基因在转录水平表现出显著差异（≥1.5倍）,差异表达的基因主要涉及到脂质代谢、酮体生成、酶调节和转录调节等代谢通路。结合RT-PCR验证的结果,发现部分重要的基因如Ephx2, Nr3c2, Igfals, Pparg, Apoa4, Hmgcs1等在OP大鼠中明显上调。差异表达的基因及相关的代谢组学结果表明肥胖个体中易发代谢性异常的部分机制和相关的代谢途径。本课题通过对高脂饮食喂养和STZ干预前大鼠尿液的代谢物分析,发现大鼠高脂饮食或化学干预前尿液中代谢物谱存在差异,而这些差异与动物干预后体重增长或血糖升高出现不同反应密切相关,这些结果为未来采用代谢组学方法预测药理学结果提供了实验依据。高脂饮食喂养建立的OP大鼠体内的整体代谢特征与OR大鼠不同,具体包括:交感神经系统活性、能量代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢以及肠道菌群结构等;OP和OR两种表型的转录组学比较也揭示了部分参与脂质代谢、酮体生成、血压调节和脂肪细胞分化等调控过程的基因存在差异性表达。两种组学研究手段的结合为系统地阐释肥胖个体的代谢特征及其发生机制提供了更加全面的信息,也为不同组学在复杂性疾病机制的整合研究提供了有益的参考和方法学。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 专业词汇缩写表
• 第一部分 前言
• 第一章 前言
• 1.1 课题背景介绍
• 1.1.1 肥胖的流行病学与危害
• 1.1.2 肥胖的发病机制研究
• 1.1.2.1 肥胖发病的遗传因素
• 1.1.2.2 肥胖发病的内分泌与代谢因素
• 1.1.2.3 肥胖发病的环境因素
• 1.1.3 肥胖动物模型
• 1.1.4 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠模型
• 1.1.5 代谢组学与转录组学
• 1.1.5.1 代谢组学的发展
• 1.1.5.2 代谢组学的研究策略
• 1.1.5.3 代谢组学的应用
• 1.1.5.4 代谢组学与转录组学的结合
• 1.2 本课题研究内容与意义
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 研究意义
• 第二部分 大鼠对高脂饮食喂养不同反应的药物代谢组学研究
• 第二章 大鼠对高脂饮食喂养不同反应的药物代谢组学研究
• 引言
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 试剂及高脂饲料配方
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 动物实验方法
• 2.1.4 尿液样品预处理方法
• 2.1.5 气相色谱/质谱（GC/MS）分析条件
• 2.1.6 数据处理与模式识别方法
• 2.1.6.1 数据前处理
• 2.1.6.2 模式识别
• 2.1.7 特征代谢物的鉴定
• 2.2 大鼠对高脂饮食喂养不同反应的实验结果
• 2.2.1 高脂饮食喂养大鼠的体重变化
• 2.2.2 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠基线尿样的 GC/MS 总离子图
• 2.2.3 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠GC/MS 数据的多维统计分析
• 2.2.4 两种体重表型间的差异代谢物
• 2.3 大鼠化学干预前尿液的代谢物分析与干预后血糖变化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 肠道菌群与动物体重的增长
• 2.4.2 基础能量代谢与体重增长
• 2.4.3 药物代谢组学与药理学评价
• 2.5 本章小结
• 第三部分 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗 大鼠的代谢组学研究
• 第三章 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠模型的建立
• 引言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 高脂饲料配方
• 3.1.3 主要设备与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠模型的建立
• 3.2.2 胰岛素耐受实验
• 3.2.3 大鼠肝脏脂质测定
• 3.2.4 血清胰岛素、脂联素、游离脂肪酸及β－羟丁酸测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 高脂饮食喂养大鼠体重的变化趋势
• 3.3.2 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠生化代谢的差别
• 3.3.3 胰岛素耐受实验
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠代谢组学研究
• 引言
• 第一节 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠尿液代谢组学分析
• 4.1 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠尿液代谢组学分析
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 实验仪器
• 4.1.1.2 实验试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 代谢组学分析策略
• 4.1.2.2 实验动物处理与样本采集
• 4.1.2.3 GC/MS 分析前处理－衍生化
• 4.1.2.5 数据处理与模型建立
• 4.1.2.6 差异代谢物的鉴定
• 4.1.3 实验结果
• 4.1.3.1 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠尿液代谢的总离子流图比较
• 4.1.3.2 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠尿液代谢的多维分析
• 4.1.3.3 差异代谢物鉴定
• 第二节 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠血清代谢组学研究
• 4.2 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠血清代谢组学研究
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 标准品与试剂
• 4.2.1.2 仪器
• 4.2.2 样本信息
• 4.2.3 试验方法
• 4.2.3.1 血清样品的三甲基硅烷化（TMS）衍生处理
• 4.2.3.2 气相色谱条件
• 4.2.3.3 数据处理与建模
• 4.2.3.4 特征代谢物的鉴定
• 4.2.4 实验结果
• 4.2.4.1 肥胖易感与肥胖抵抗血清样本总离子流图比较
• 4.2.4.2 肥胖易感与肥胖抵抗动物血清样本的多维统计分析
• 4.2.4.3 血清差异代谢物鉴定
• 第三节 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠肝脏组织代谢组学研究
• 4.3 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠肝脏组织代谢组学研究
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.1.1 实验器材
• 4.3.1.2 实验试剂
• 4.3.1.3 肝脏组织样本
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.2.1 肝脏组织代谢物的提取
• 4.3.2.2 肝脏组织代谢物的衍生化
• 4.3.2.3 肝脏组织代谢物测定的GC/MS 条件
• 4.3.2.4 数据处理
• 4.3.2.5 肝脏差异代谢物鉴定
• 4.3.3 实验结果
• 4.3.3.1 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠肝脏组织提取物总离子图
• 4.3.3.2 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠肝脏组织提取物的多维统计
• 4.3.3.3 肝脏组织提取物中的差异代谢物
• 4.5 本章讨论
• 4.5.1 基于不同生物体液与组织的代谢组分析为肥胖的研究提供更全面的信息
• 4.5.2 系统交感神经活性与体重相关的代谢性异常
• 4.5.3 肠道菌群结构差异与体重增长
• 4.5.4 氨基酸代谢差异与体重
• 4.5.5 脂肪酸代谢与体重
• 4.5.6 能量代谢与体重增长
• 4.6 本章小结
• 第四部分 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠转录组学研究
• 第五章 高脂饮食诱导的肥胖易感与肥胖抵抗大鼠转录组学研究
• 引言
• 5.1 试剂
• 5.2 仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 基因表达谱的检测
• 5.3.1.1 总RNA 的提取
• 5.3.1.2 RNA 的纯化
• 5.3.1.3 RNA 体外转录和放大
• 5.3.1.4 cRNA 的纯化与探针后标记
• 5.3.1.5 芯片杂交和洗涤
• 5.3.1.6 数据处理与分析
• 5.3.2 cDNA 芯片结果验证
• 5.3.2.1 引物设计
• 5.3.2.2 荧光实时定量 PCR
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 基因表达谱分析
• 5.4.1.1 质量控制
• 5.4.1.2 聚类分析与差异基因筛选
• 5.4.1.3 Real time RT-PCR 验证
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 参考文献
• 第五部分 结论
• 第六章 研究总结与展望
• 6.1 研究工作总结
• 6.1.1 大鼠对高脂饮食喂养不同反应的药物代谢组学研究
• 6.1.2 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠模型的建立
• 6.1.3 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠代谢组学研究
• 6.1.4 肥胖易感与肥胖抵抗大鼠转录组学比较
• 6.2 全文结论
• 6.3 论文创新点
• 6.4 展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要研究成果