论文摘要
乙酰化是一种可逆的蛋白共价修饰形式,主要发生在蛋白质多肽链的赖氨酸残基上。组蛋白的乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase, HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）共同调控。乙酰化的组蛋白与DNA解离,染色质结构变得疏松,便于转录因子与DNA结合,促进基因的转录与表达。肿瘤细胞中HDAC过度表达,组蛋白处于低乙酰化状态,抑癌基因及促凋亡基因的表达受到抑制,细胞过度增殖,因此HDAC成为肿瘤治疗的新靶点。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）是一类以HDAC为靶点的小分子化疗药物,能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞分化和凋亡,在体内外的实验中都表现出显著的抗癌活性。Depsipeptide （FK228, FR 901228, NSC630176）是一种环形肽类HDACi,对多种血液肿瘤和实体瘤都具有明显的杀伤作用,在部分肿瘤的I/II期临床实验中也表现出显著的疗效。尽管以往的研究表明FK228可以促进组蛋白及一些重要非组蛋白的乙酰化修饰,调节相关基因的表达和蛋白的降解,从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡,但其确切的肿瘤杀伤机制尚不完全清楚。此外,临床前资料显示不同肿瘤细胞对HDACi的药物敏感性具有明显差异,但是具体的调控机制尚无相关报道。本实验采用双向电泳及质谱技术,筛选并鉴定了FK228调控的差异蛋白,并对这些差异蛋白在FK228杀伤肿瘤细胞中的作用进行了深入的探讨,所获得的实验结果将有助于进一步阐明FK228的作用机制,并为HDACi的理论研究和未来的临床应用提供重要参考。研究内容及结果1. FK228显著抑制肿瘤细胞增殖,并诱导caspase依赖的细胞凋亡MTT实验结果表明FK228时间依赖性地抑制非小细胞肺癌（H322和H1299）细胞及前列腺癌（LNCaP和PC-3）细胞的增殖,同时克隆形成实验结果显示FK228对H322和H1299细胞具有明显的杀伤作用。FK228活化caspase通路,促进caspase-3及其底物蛋白PARP的剪切,从而诱导caspase依赖的细胞凋亡。此外,H322和LNCaP细胞对FK228的杀伤作用比较敏感,而H1299和PC-3细胞则相对耐受。2. FK228调控的差异蛋白筛选、鉴定及验证以往的研究表明FK228通过调控靶蛋白的表达和稳定性来发挥抗癌作用,因此鉴定FK228的靶蛋白将进一步揭示其作用机制。本实验以H322细胞为模型,利用双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）和MALDI-TOF-MS筛选并鉴定了FK228调控的差异蛋白,共鉴定35个具有显著变化的蛋白点,包括20个下调的蛋白点和15个上调的蛋白点,分别代表27种不同的蛋白。我们利用RT-PCR和Western blotting实验进一步验证了TrxR、HSP27、CRT、GRB2、G3BP、HMGB1、FBP1、hnRNP K、PKM2和RCN1等10种鉴定蛋白的变化,结果显示大部分蛋白在mRNA和蛋白水平的变化趋势与2-D检测结果一致,因此蛋白质组学结果准确的反应了FK228调控的差异蛋白的变化。根据功能不同,27种鉴定蛋白分为五类,分别是信号转导、转录调控、能量代谢、细胞骨架及蛋白质合成、折叠及降解。大部分鉴定蛋白的变化有利于促进FK228对肿瘤细胞的杀伤,提示FK228可能通过调控多种信号通路来抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。3.调控HDACi敏感性靶蛋白的筛选和鉴定FK228对多种肿瘤细胞都具有杀伤作用,但是不同的肿瘤细胞对FK228的敏感性也不相同,本实验中我们也发现H322和LNCaP细胞对FK228的敏感性显著高于H1299和PC-3细胞。为了鉴定调控FK228敏感性的靶蛋白,我们检测了TrxR、HSP27、CRT和GRB2四种鉴定蛋白与FK228敏感性之间的相关性。FK228抑制HDACi敏感型（H322和LNCaP）细胞中TrxR和HSP27的表达,上调HDACi耐受型（H1299和PC-3）细胞中TrxR的表达,但对HSP27的表达没有显著的影响。CRT和GRB2的表达水平在FK228处理后的肿瘤细胞中都上调,因此与FK228的敏感性无关。TrxR和HSP27的差异表达与肿瘤细胞对FK228的敏感性一致,是调控HDACi敏感性的候选蛋白。4. HSP27在FK228诱导细胞凋亡过程中的作用HSP27是一种分子伴侣蛋白,具有抗凋亡功能,其变化趋势与FK228的敏感性一致,因此我们利用过表达和RNA干扰技术进一步研究了HSP27在FK228诱导细胞凋亡过程中的作用。与对照组相比,H322细胞过表达HSP27并未抑制FK228诱导的细胞凋亡,而利用HSP27 siRNA阻断H1299细胞内HSP27的表达后,H1299细胞对FK228的杀伤敏感性没有显著变化。因此,HSP27不参与调控FK228诱导的细胞凋亡,与HDACi的敏感性无关。5. TrxR的表达变化与HDACi敏感性的相关性TrxR是一种还原酶类,通过还原其底物蛋白Trx或H2O2来清除细胞内的ROS,保护细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡。本实验中我们发现TrxR是调控FK228敏感性的候选蛋白,但尚不清楚TrxR是否通过Trx来发挥作用,因此我们检测了HDACi敏感和耐受型细胞中TrxR及Trx水平在FK228处理前后的变化。在敏感型细胞中FK228抑制TrxR、微弱上调Trx的表达;而在耐受型细胞中却上调TrxR、降低Trx的表达。此外,TrxR还原活性的变化与其蛋白水平变化相一致。提示Trx的表达变化与FK228的敏感性无关,而TrxR可能是通过其还原其他抗氧化蛋白或H2O2来调控肿瘤细胞对FK228的敏感性。6. FK228对肿瘤细胞中ROS水平及DNA损伤的影响TrxR和Trx能够清除细胞内的ROS,保护DNA等生物大分子免受ROS诱导的氧化损伤。本实验发现FK228时间依赖性地清除敏感性细胞中的TrxR及耐受型细胞中的Trx,那么FK228可能提高肿瘤细胞内的ROS水平并诱导DNA损伤。为了证明这一推论,我们检测了FK228处理前后肿瘤细胞内的ROS水平和DNA损伤状态。结果表明FK228时间依赖性地提高H322和H1299细胞内的ROS水平,诱导DNA损伤,且H322细胞的敏感性显著高于H1299细胞。由于ROS的异常积累及DNA损伤都能够诱导细胞凋亡,因此FK228可能是通过诱导ROS积累和DNA损伤来发挥抗癌活性。7. TrxR对FK228诱导的ROS积累及细胞凋亡的影响TrxR是调控FK228敏感性的候选蛋白,为了进一步验证TrxR对FK228敏感性的调控作用,我们检测了敲除TrxR后细胞凋亡的变化。转染TrxR siRNA能够显著抑制H1299细胞中TrxR的表达,促进PARP的剪切和ROS的积累,因此TrxR的敲除促进了FK228诱导的细胞凋亡,TrxR参与调控肿瘤细胞对HDACi的敏感性。本实验首次利用蛋白质组学技术鉴定了27种FK228调控的差异蛋白,分别与信号转导、转录调控、能量代谢、细胞骨架及蛋白质的合成、折叠及降解等生物学功能相关,其中HSP27和TrxR的差异表达与肿瘤细胞对FK228的敏感性一致,但是HSP27对FK228诱导的细胞凋亡没有调控作用,因此与HDACi的敏感性无关。TrxR的表达变化与FK228诱导的ROS积累,DNA损伤及细胞凋亡的变化趋势一致,且敲除TrxR后促进FK228诱导的ROS积累及细胞凋亡,因此TrxR参与调控肿瘤细胞对HDACi的敏感性。
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