论文摘要
目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病的一种慢性并发症,严重危害人类的健康。其发病机制复杂,涉及许多方面,例如高血流灌注、糖基化末端产物、氧化应激、免疫损伤、遗传易感因素、肾小球细胞外基质堆积和血脂异常等。近年来,随着研究的深入,人们发现肾脏自身脂质代谢的异常改变在糖尿病肾病发生中也发挥着作用。固醇调节元件结合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Proteins,SREBPs）是调控脂肪酸和甘油三酯代谢的重要转录因子,其靶基因众多,涉及胆固醇合成、LDL摄取、脂肪酸合成和去饱和、甘油三酯合成等重要生理过程。SREBPs在糖尿病肾脏中表达和脂质代谢异常之间的关系还未完全阐明。有研究发现不饱和脂肪酸、慢性间断性缺氧、肝X受体（LXR）、胰岛素、高糖等可影响SREBP-1表达,但高糖是否影响糖尿病肾脏SREBP-1表达还鲜有报道。RNA干扰自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点。基于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法。靶向抑制人SREBP-1基因的shRNA真核表达载体的构建为下一步的体内外研究奠定了良好的基础,并为疾病的预防治疗提供了新的思路和理论指导。因此,本研究应用大鼠糖尿病模型和体外培养的肾小管上皮细胞,从整体、细胞和分子等不同水平,系统观察了糖尿病肾脏中SREBPs蛋白表达情况及其靶基因调控;并构建并鉴定了抑制人SREBP-1基因的shRNA真核表达载体。方法1.SREBP-1和SREBP-2在糖尿病大鼠肾脏的表达和意义将实验动物随机分为正常对照组（N组,25只）、糖尿病组（DM组,25只）和胰岛素处理组（INS组,10只）。糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ,溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5,60 mg/kg）,对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液,48h后尾尖取血,血糖≥16.7mmol/L者确定为Ⅰ型DM模型。分别于注射STZ后1、2、4、8周每组取6只大鼠,称重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,离心分离血清,用于测定血糖、血甘油三酯和胆固醇;取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,用于免疫组化检测;部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于-80℃冰箱,用于冰冻切片制作和提取蛋白及RNA。应用免疫组化、Western blot以及RT-PCR观察糖尿病大鼠肾脏SREBP-1、SREBP-2蛋白及mRNA表达的影响。2. SREBP-1重组质粒在人肾小管上皮细胞内的表达和影响采用CaCl2法制备DH5a感受态,将惠赠的SREBP-1重组质粒溶解并转化感受态,摇菌扩增后酶切鉴定并大量提取。人肾小管上皮细胞（HKC细胞）用含10%胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,培养条件为37℃,5%CO2。经同步化后将细胞随机分为3组,空白细胞对照组、pcDNA3.1空质粒对照组和pcDNA3.1-SC1质粒转染组。转染采用阳离子脂质体法,48小时后终止培养进行油红O染色和蛋白、RNA提取。采用Western blot检测SREBP-1蛋白表达;半定量RT-PCR检测细胞内SREBP-1 mRNA、FAS mRNA的表达。3.高糖对人肾小管上皮细胞SREBP-1表达和脂滴形成的影响人肾小管上皮细胞用含10%胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,将实验细胞分成2组,分别为:高糖组（30mmol/L,High glucose, HG）;正常糖组（5.5mmol/L,normal glucose, NG）。于刺激后12、24、48和72小时收集细胞,提取总蛋白,Western blot检测SREBP-1蛋白的表达;同时提取细胞总RNA,进行SREBP-1 mRNA检测;细胞内脂滴形成情况采用油红O方法检测。4.针对SREBP-1基因的shRNA真核表达质粒构建及鉴定设计和构建能表达针对SREBP-1基因的siRNA的RNA干扰载体和表达不针对任何已知人类基因的siRNA的RNA干扰阴性对照载体,分别通过脂质体介导转染至HKC细胞。HKC细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液,在5%CO2、37℃培养箱中培养。将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,24h后待细胞长至70-80%左右开始转染,共分3组:①实验组:转染pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2;②空白对照组:未转染组;③阴性对照组:转染pGenesil-HK。转染步骤按Lipofectamine2000说明书进行,48小时后进行蛋白和RNA的提取,采用Western blot检测SREBP-1的表达;半定量RT-PCR检测细胞SREBP-1 mRNA的表达。结果1. SREBP-1和SREBP-2在糖尿病大鼠肾脏的表达和意义同正常组大鼠相比,糖尿病大鼠肾脏胆固醇含量没有明显变化,而甘油三酯含量在1、2、4、8周均出现了明显升高。冰冻切片油红O染色可见糖尿病大鼠肾脏近曲小管上皮细胞内出现明显脂滴,呈红染颗粒状,而肾小球内未见有脂滴染色。免疫组织化学检测发现,SREBP-1在正常大鼠和糖尿病大鼠肾脏定位于近曲小管上皮细胞胞浆,胞核无着色,肾小球内未见有棕黄色颗粒。经图像分析显示:SREBP-1在糖尿病大鼠肾脏表达在4个时间点均明显高于正常大鼠,其中2周时SREBP-1表达量最高,IPP软件分析阳性区域积分光密度值（IOD）为80019.17±5698.51,是正常大鼠的2.43倍。SREBP-1蛋白有两种形式:前体和成熟片段（活性形式）,本研究采用Western blot进一步检测了这两种形式的表达,结果发现糖尿病大鼠肾组织在四个时间点均呈高表达,2周表达量最高,前体为0.673±0.027,成熟片段为0.670±0.028。SREBP-1 mRNA的检测应用原位杂交技术,结果证实正常对照组大鼠肾脏内未见明显表达,糖尿病模型鼠肾皮质内有明显棕黄色颗粒出现,定位于肾小管上皮细胞胞浆,肾小球内未见着色。注射胰岛素处理2周后,蛋白印迹检测结果分析发现相对于正常大鼠,模型鼠肾脏SREBP-1前体表达下降了52.8%,相似地,成熟片段表达量下降了30.9%。原位杂交结果证实胰岛素处理避免了糖尿病大鼠SREBP-1 mRNA的上调。相应地肾脏甘油三酯含量检测也发现胰岛素处理引起甘油三酯含量的相应下降。免疫组织化学检测发现在正常大鼠和糖尿病大鼠肾脏SREBP-2均未有明显表达,仅部分区域有较淡着色。进一步采用Western blot证实前体和成熟片段在对照组和糖尿病组间表达无统计学差异。2. SREBP-1重组质粒在人肾小管上皮细胞内的表达和影响重组质粒转染人肾小管上皮细胞48小时后,应用RT-PCR技术进行了细胞内SREBP-1 mRNA表达的检测,pcDNA3.1-SC1重组质粒转染的细胞内SREBP-1 mRNA表达呈现明显升高,扩增条带积分光密度值为1.237833±0.095468,分别是空白对照组和阴性对照组的6.158倍和4.194倍。SREBP-1蛋白的表达检测采用Western blot方法,结果显示:pcDNA3.1-SC1重组质粒转染48小时后SREBP-1蛋白出现明显上调,在68kD位置上出现深染条带,经LabWorks软件分析条带积分光密度值为3.091833±0.253996;相反地,对照组均未见SREBP-1的高表达。采用油红O染色方法检测细胞内脂滴形成情况。空白对照组和pcDNA3.1阴性对照组细胞内均未见有红染脂滴颗粒,而pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组中出现了清晰的红染颗粒。FAS mRNA表达检测发现在pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组细胞中,FAS mRNA出现明显升高,表达量远远高于对照组。3.高糖对人肾小管上皮细胞SREBP-1表达和脂滴形成的影响正常糖组肾小管上皮细胞未见脂滴形成,高糖刺激12、24小时同样未见有脂滴,48、72小时组细胞内可见较多的、明显的脂滴,染成红色、颗粒状。经免疫细胞化学检测,SREBP-1表达于胞浆,高糖刺激后,肾小管上皮细胞内SREBP-1的表达高于正常糖组,差异有统计学意义（P<0.01）其中48小时组,正常糖组IOD值为6522555.167,高糖组为17946742.17,差异最为显著。Western Blot检测SREBP-1蛋白前体片段和成熟片段表达,结果显示12、24、48、72小时高糖组SREBP-1前体（125kD）和成熟体（68kD）表达量均高于正常糖组,差异有统计学意义;同时发现,高糖刺激下SREBP-1前体和成熟体表达随时间延长逐渐增多,到48小时达到高峰,72小时有所回落。半定量RT-PCR分析显示:和蛋白水平结果相似,高糖明显上调了SREBP-1 mRNA的表达,在4个时间点,高糖组表达量均明显高于正常糖对照组。4.针对SREBP-1基因的shRNA真核表达质粒构建及鉴定质粒pGenesil-1（Fig4-1）的多克隆位点（MCS）如下:—HindIII—ShRNA—BamHI—U6 Promotor—EcoRI—SalI—XbaI—DraIII—在插入的目的基因片段之后,我们设计了一个SalI的酶切位点,插入在质粒pGenesil-1的BamHI和HindIII之间,如若插入正确,就能被SalI酶切出一条约400bp的DNA片段。合成的寡核苷酸片段退火后产物、BamHI和HindIII双酶切后的线性化pGenesil-1质粒经琼脂糖电泳检测位置均正确,T4连接酶连接后转化、挑菌、提质粒,经酶切鉴定和测序分析,质粒均符合设计要求,命名为pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2。转染HKC细胞24小时后荧光倒置显微镜下即可见绿色荧光蛋白开始表达,至48小时表达量明显增多。HKC细胞转染48小时后提取RNA,进行反转录后检测SREBP-1表达,结果显示:与未转染组和阴性对照质粒组相比,pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2质粒转染组可见SREBP-1 mRNA水平下降,抑制率分别为24.11%和36.15%。Western blot检测SREBP-1蛋白表达发现pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2质粒转染均可引起SREBP-1蛋白表达下降,SREBP-1前体片段分别比阴性质粒对照组减少20.80%和37.59%,成熟片段分别比阴性质粒对照组减少38.12%和52.24%。结论:①Ⅰ型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞SREBP-1蛋白表达明显升高,SREBP-1 mRNA水平亦明显上调,肾脏甘油三酯含量显著增多,给与胰岛素处理后均呈现明显下降。高糖-SREBP-1-甘油三酯途径可能参与了糖尿病肾病脂质沉积的发生和发展。②人重组质粒pcDNA3.1-SC1能够激活体外培养的人肾小管上皮细胞SREBP-1蛋白表达,上调脂肪酸合成酶并引起细胞脂质合成增多。③高糖可诱导人肾小管上皮细胞SREBP-1 mRNA和蛋白的表达并引起细胞内脂滴形成增多。④成功构建了针对SREBP-1基因的shRNA真核表达质粒,在人肾小管上皮细胞的转染和表达引起SREBP-1 mRNA和蛋白的减少。
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