亚历山大藻分子鉴定和荧光原位杂交检测方法研究

论文摘要

近年来,世界沿海国家有害赤潮发生的频率、规模及危害都有上升趋势,有害赤潮已经成为重要的近海环境问题之一。要有效防范有害赤潮带来的危害效应,建立和发展可靠、有效的赤潮监测手段非常重要。目前,对于赤潮藻种的监测主要依靠显微观察的方法,在实际应用中经常遇到困难。首先,亲缘关系相近的物种在形态上差异很小,如甲藻门亚历山大藻属的一些种类,仅细胞壁上个别甲片的结构有细微差别,并且这些形态学指标还容易受环境条件及生长阶段的影响。另外,这种以形态学为基础的分析方法,分析速度慢、耗时长,对操作人员的要求较高,难以满足浮游植物种群动力学监测“量大、连续”的要求。因此,本研究将分子生物学的技术和方法应用于赤潮监测,力求提高赤潮藻种鉴定的准确性和检测工作的效率。亚历山大藻是一类重要的有害赤潮藻,该藻属中一些产毒特性差别很大的藻种,单从表形特征难以明确区分,从而限制了基于形态观察的监测技术的应用。本研究中,我们尝试应用分子生物学技术与方法,开展了该藻属藻种分子鉴定和荧光原位杂交检测方法的研究。在亚历山大藻的分子鉴定方面,我们采用了核糖体RNA基因（rDNA）序列分析的方法,首次测定了9株分离自中国沿海的（以及实验室保有的其它两株）亚历山大藻的rDNA序列全长,其中包括核糖体小亚基（SSU）rDNA、大亚基（LSU）rDNA、5.8S rDNA及内转录间隔区（ITS）区序列。序列分析结果显示,这些藻株包含了5种核糖体类型,分别是塔玛复合种亚洲温带（Temperate Asian）核糖体类型（TSC-TA）,塔玛复合种西欧（West European）核糖体类型（TSC-WE）,相关亚历山大藻（A. affine）核糖体类型（AF）,微小亚历山大藻（A. minutum）葡萄牙（Portugal）核糖体类型（M-PO）和微小亚历山大藻新西兰（New Zealand）核糖体类型（M-NZ）。将测获的rDNA序列划分为若干保守性不同的区段,分别进行系统发育分析（结合GenBank数据库中保存的其它亚历山大藻相关序列）。结果显示,LSU rDNA D1-D2区是对该藻属藻种进行分子鉴定和系统发育研究的较好区段。同时,为解决建立亚历山大藻克隆培养的困难,我们应用单细胞rDNA序列分析方法,对亚历山大藻单个细胞直接进行了种类鉴定。结果表明,该方法适用于不同生活史阶段的亚历山大藻。在亚历山大藻的检测技术方面,我们进一步扩展和完善了针对完整细胞的荧光原位杂交检测方法。首先,通过对不同核糖体类型藻株rDNA序列信息的对比分析,针对各自特异的序列位点,设计了特异性rRNA标记探针。经荧光原位杂交实验检验,实现了对5种核糖体类型亚历山大藻的特异性标记。其中,针对WE、M-PO及M-NZ核糖体型的特异性探针为首次获得,另外两个探针是针对TA和AF核糖体类型rRNA新的位点所设计。同时,对影响探针标记效果的诸多因素进行了分析和探讨。此外,在2007年春季长江口海域赤潮调查中,首次应用特异性核酸探针和荧光原位杂交检测方法,调查了该海域亚历山大藻的丰度。结果表明,在4月4日-4月10日的样品中,亚历山大藻达到了较高的密度,最高密度达到103cells/L。同时发现,实验中样品的保存方法有待改进。随后的研究表明,盐醇固定方法及多聚甲醛/甲醇固定方法,可以较好的保持rRNA不被降解并适宜杂交（至少3个月时间）。总之,本研究首次测定并分析了11株亚历山大藻（9株分离自中国沿海）的rDNA全序列信息。在此基础上,获得了5种核糖体类型亚历山大藻的特异性rRNA标记探针,其中3种为首次获得。另外,实验证明,单细胞rDNA分析技术和荧光原位杂交检测方法,在自然水体中亚历山大藻的直接鉴定及丰度调查中,均具有良好的应用前景。这一工作为我国近海亚历山大藻的鉴定和检测提供了理论依据和方法学基础,希望对该藻赤潮的监测工作有推动作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 有毒赤潮研究概况
• 1.2 分子生物学技术在有毒赤潮研究中的应用
• 1.2.1 有毒赤潮研究对新技术的需求
• 1.2.2 分子生物学技术在有毒赤潮研究与监测中的应用
• 1.2.3 分子生物学技术在亚历山大藻研究中的重要性
• 第二章 文献综述
• 2.1 赤潮原因种分子鉴定和检测
• 2.1.1 赤潮原因种分子鉴定的遗传学基础
• 2.1.2 表型进化与基因型进化之间的差异
• 2.1.3 分子鉴定指标的选择
• 2.1.4 赤潮原因种分子鉴定和检测的新技术
• 2.2 亚历山大藻的分子生物学鉴定
• 2.2.1 rDNA 分子扩增产物RFLP 分析
• 2.2.2 rDNA 部分序列分析
• 2.2.3 亚历山大藻塔玛复合种分子进化的“单源辐射”假说及其散布
• 2.3 亚历山大藻的分子鉴定与检测技术
• 2.4 小结
• 第三章 亚历山大藻的分子鉴定和系统发育分析
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验藻株及培养条件
• 3.1.2 DNA 制备和rDNA 靶序列的扩增、克隆和测序
• 3.1.3 亚历山大藻rDNA 分子全长序列的综合分析
• 3.1.4 甲藻系统发育学研究
• 3.1.5 亚历山大藻系统发育学研究
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 亚历山大藻rRNA 基因序列全长的测定和分析
• 3.2.2 甲藻系统发育学研究
• 3.2.3 亚历山大藻系统发育学研究
• 3.3 讨论
• 3.3.1 核糖体RNA 基因用于亚历山大藻分类研究的有效性
• 3.3.2 核糖体RNA 基因用于亚历山大藻种系进化研究的有效性
• 3.4 小结
• 第四章 单细胞rDNA 分析技术的建立和应用
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验藻株及培养条件
• 4.1.2 不同生活史阶段藻细胞的鉴别
• 4.1.3 单细胞PCR 模板制备
• 4.1.4 单细胞PCR 扩增条件
• 4.1.5 PCR 扩增产物的序列测定及分析
• 4.1.6 单细胞rDNA 分析样品保存方法的摸索
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同生活史阶段亚历山大藻细胞鉴别
• 4.2.2 单细胞PCR 扩增
• 4.2.3 序列测定结果及比较分析
• 4.2.4 单细胞rDNA 分析样品保存方法的摸索
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 核糖体RNA 标记探针的设计和检验
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 实验藻株及培养条件
• 5.1.2 探针设计与合成
• 5.1.3 探针特异性检验
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 亚洲温带核糖体类型特异性探针的设计和检验
• 5.2.2 西欧核糖体类型特异性探针的设计和检验
• 5.2.3 相关亚历山大藻核糖体类型特异性探针的设计和检验
• 5.2.4 微小亚历山大藻（葡萄牙）核糖体类型特异性探针的设计和检验
• 5.2.5 微小亚历山大藻（新西兰）核糖体类型特异性探针的设计和检验
• 5.3 讨论
• 5.3.1 不同探针标记效果的差异
• 5.3.2 核糖体RNA（rRNA）标记探针的设计
• 5.3.3 杂交反应条件对探针标记效果的影响
• 5.4 小结
• 第六章 应用荧光原位杂交方法检测长江口邻近海域的亚历山大藻
• 6.1 长江口邻近海域亚历山大藻的检测
• 6.1.1 实验材料与方法
• 6.1.2 实验结果
• 6.1.2.1 亚历山大藻荧光原位杂交方法检测结果
• 6.1.2.2 两种方法检测结果对比
• 6.1.3 讨论
• 6.2 野外样品保存方法研究
• 6.2.1 实验材料与方法
• 6.2.2 实验结果
• 6.2.2.1 不同保存方法处理样品的标记情况
• 6.2.3 讨论
• 6.3 小结
• 结论
• 参考文献
• 文中图目录
• 文中表目录
• 附录
• 发表和完成文章目录
• 致谢