论文摘要
本研究系统地从普洱茶分离出多个组分,利用多种抗氧化实验模型,分别研究各组分的抗氧化能力;根据抗氧化实验结果,找出了抗氧化能力强的普洱茶特异多酚类物质,与儿茶素类物质没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）进行对照比较,研究它们对3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞的生理功能的作用,从而探讨出普洱茶直接作用于脂肪细胞的减肥途径。1.普洱茶抗氧化特性的初步研究许多研究结果表明,自由基与人体疾病有密切关系。普洱茶具有诸多的保健功效,很大程度归结于其含有能清除人体过量自由基的抗氧化成分。本研究系统地将普洱茶划分为氯仿萃取层,乙酸乙酯萃取层,正丁醇萃取层,70%乙醇沉淀物,萃取后残余物等五大萃取组分。采用体外抗氧化实验和小鼠抗氧化实验模型,分析普洱茶中起抗氧化作用的主要组分。主要研究结果如下:1)普洱茶水提物中的乙酸乙酯萃取层组分和正丁醇萃取层组分对DPPH和羟自由基均有较强的清除能力。2)绿茶,红茶和普洱茶,均对正常小鼠的抗氧化指标具有正相关效应,其中红茶和普洱茶,在各项指标上,要比绿茶作用效果更强。普洱茶水提物的70%乙醇沉淀物,即普洱茶多糖部分,普洱茶水提物正丁醇萃取层和普洱茶水提物乙酸乙酯萃取层,即普洱茶的多酚和色素部分,对普洱茶在小鼠的抗氧化作用上,均有很好的正相关效应。普洱茶水提物萃取后残余物,在对小鼠的抗氧化作用上,没有相关效应。上述结果表明,普洱茶的乙酸乙酯萃取层,正丁醇萃取层在体外具有直接清除自由基的能力,是普洱茶清除自由基的主要成分。普洱茶的乙酸乙酯萃取层,正丁醇萃取层和70%乙醇沉淀物,是普洱茶提高小鼠抗氧化能力的主要组分。2.普洱茶特异多酚类物质的研究普洱茶与红、绿茶的主要区别在于它经过特殊的加工工艺,可能含有具有强抗氧化性能的特异多酚类物质。本研究采用系列溶剂萃取和柱色谱分离的办法,将乙酸乙酯萃取物分离成为八个不同的组分,正丁醇萃取物分离成为五个不同的组分;能后检测普洱茶各分离物对羟自由基、超氧阴离子自由基的体外清除能力;采用正常二倍体男性胚肺成纤维细胞（HPF-1）,用双氧水和高浓度葡萄糖进行损伤,加入普洱茶的各分离组分检测其保护作用;通过检测细胞内活性氧试验,探讨普洱茶各组分对细胞氧化损伤的保护作用机理。另外,对具有强抗氧化性能的分离组分,再通过单线态氧,DPPH,ABTS+,脂质过氧化等体外实验,全面探讨其抗氧化性能。主要研究结果如下:1)普洱茶乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及柱分离的组分,对羟自由基,超氧阴离子,具有很好的清除作用。乙酸乙酯萃取物的第二、第八组分,正丁醇萃取物的第二、第四和第五组分,对双氧水和高浓度葡萄糖引起的细胞损伤,具有很好的保护作用,在正常培养条件下,还能够增加细胞活力,各分离组分,可以通过减少被损伤细胞内的活性氧的积累,保护被损伤的细胞。2)普洱茶乙酸乙酯萃取物的第八组分（PEF8）,在上述试验中,具有比EGCG更强的活性作用,但通过高效液相色谱分析,其组分中,几乎不含茶叶中典型的单体多酚,茶黄素和没食子酸。3)对PEF8的进一步研究,如清除单线态氧、ABTS+和DPPH自由基实验,抑制脂质过氧化实验,结果表明,PEF8在这些抗氧化实验中,其抗氧化能力也是与EGCG的抗氧化能力比较接近的。上述结果表明,普洱茶具有很好的抗氧化能力。普洱茶经过长时间的后发酵和储藏过程,化学成分发生很大的改变。其中的一些氧化产物,如乙酸乙酯萃取物的第八组分,具有很好的抗氧化能力,但其组分中,几乎不含有红茶和绿茶中典型的单体多酚,茶黄素和没食子酸,其成分分离和结构鉴定,具有很重要的意义。3.普洱茶提取物对脂肪细胞生理功能的作用研究绿茶多酚（多数实验用EGCG研究）能有效的防治肥胖症及其相关的疾病,其可能途径是直接影响脂肪细胞和前脂肪细胞的生理功能。大量动物实验,细胞实验都有证据表明普洱茶具有很好的降脂减肥作用。普洱茶乙酸乙酯萃取层分离的特异多酚类组分PEF8,具有很强的抗氧化性能。本研究检测了PEF8和EGCG对3T3-L1前脂肪细胞的细胞活力,细胞凋亡和细胞增殖的影响;通过检测细胞内的活性氧,检测细胞内与凋亡相关蛋白,肿瘤坏死因子α（TNFα）、磷酸化氨基末端蛋白激酶（P-JNK）、核转录因子-κB（NF-κB）的表达情况,探讨PEF8和EGCG减少前脂肪细胞的活力,诱导细胞凋亡,减少细胞增殖的作用途径。检测了PEF8和EGCG对3T3-L1前脂肪细胞的分化的影响,对3T3-L1成熟脂肪细胞的脂解的影响,并通过检测细胞内与分化和脂质生成相关的蛋白,CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPβ,C/EBPα）,过氧化物酶体增殖剂受体γ（PPARγ）的表达情况,探讨其作用途径。主要研究结果如下:1)普洱茶提取物PEF8或EGCG均能够呈剂量性和时间性地降低3T3-L1前脂肪细胞的活力,PEF8能够呈剂量性和时间性地降低前脂肪细胞的增殖。PEF8或EGCG处理汇合前3T3-L1前脂肪细胞（对数生长期,约70%）48h,能够引起细胞的大量凋亡,而对汇合后的3T3-L1前脂肪细胞进行处理,只能引起较小的凋亡。2)2μg╱ml到50μg╱ml的EGCG处理汇合前3T3-L1前脂肪细胞（对数生长期,约70%）3h能够减少细胞内活性氧的含量,但随着浓度的增加,细胞内的活性氧的减少量反而减少,2μg/ml到10μg/ml的PEF8处理汇合前3T3-L1前脂肪细胞也能够引起细胞内的活性氧下降,但在20μg/ml和50μg/ml的浓度下,细胞内的活性氧含量反而增加。3)PEF8或EGCG处理汇合前3T3-L1前脂肪细胞（对数生长期,约70%）48h,能够诱导与凋亡相关的蛋白TNFα和NF-κB的升高,降低P-JNK的表达,同时还能够降低与前脂肪细胞分化有关的C/EBPβ和C/EBPα的表达。4)用PEF8或EGCG处理汇合后的3T3-L1前脂肪细胞,能够提高PPARγ的表达,促进细胞的分化。5)PEF8和EGCG处理3T3-L1成熟脂肪细胞,能够促进细胞的脂解,减少成熟脂肪细胞的数目和体积,从而减少细胞内甘油三酯含量。从这些实验结果可以看出,PEF8和EGCG可以通过改变细胞内活性氧的含量,诱导TNFα和NF-κB的表达增加,降低P-JNK的表达来引起汇合前的前脂肪细胞的活力的减少,抑制前脂肪细胞的增殖,诱导前脂肪细胞的凋亡,同时能够下调与前脂肪细胞分化有关的C/EBPβ和C/EBPα的表达。前脂肪细胞的不同生长状态（汇合前和汇合后）对PEF8和EGCG引起的凋亡的敏感性相差很大,PEF8和EGCG能够诱导汇合后的前脂肪细胞内的PPARγ表达的增加,从而促进前脂肪细胞的分化,提高细胞内的甘油三酯的含量,但同时PEF8和EGCG能够促进3T3-L1成熟脂肪细胞的脂解,减少成熟脂肪细胞的数目和体积,从而减少细胞内甘油三酯含量。
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