谷氨酸受体相互作用蛋白介导AMPA受体兴奋性毒性效应

论文摘要

脑卒中是一类常见致死性与致残性疾病，卒中发生时由于脑缺血导致兴奋性谷氨酸递质的大量释放入细胞外间隙，激活离子型谷氨酸受体引发钙内流、兴奋性毒性损伤与易损区神经元丢失是过去二十多年来的研究成果。但至今尚不清楚不同类型钙透性谷氨酸受体在引发神经元丢失的特异性作用以及为什么脑中有些区域如海马CA1锥体细胞、纹状体棘细胞与皮质投射神经元对谷氨酸兴奋性毒性损伤异常敏感。中枢神经系统（CNS）内离子型谷氨酸受体激活引发离子快速内流在介导快速突触传递、突触可塑性改变以及学习与记忆中其重要作用，但在病理状态下如缺氧、缺血，谷氨酸受体过渡激活会导致过多的钙、钠、锌离子内流就会导致神经兴奋性毒性损伤。CNS内离子型谷氨酸受体主要分三类即N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体、α-氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPA）受体、海人藻酸（KA）受体。因为所有NMDA受体均透过钙，起初的缺血损伤研究多集中于对该类受体的研究，然而近来已经有越来越多的研究指向钙透型AMPA受体，AMPA受体是一类由GluR14亚基以不同聚合形式形成的异源聚体，缺乏GluR2亚基的AMPA受体是透钙与锌离子的，GluR2亚基由于第二次跨膜区存在精氨酸可以阻滞含该亚基的AMPA受体通过钙离子，编码GluR2的基因组DNA是无此密码子的，只是在前mRNA水平在神经元内一种腺嘌呤脱氨酶的作用下，将原编码谷氨酸CAG中的A转化为I导致编码精氨酸，正常状态下脑内几乎100%的GluR2均是经过此加工的，因此绝大多数含GluR2的AMPA受体是不透钙的。以前的研究发现脑缺血可特异性导致CA1区GluR2mRNA与蛋白表达降低，由此形成了“脑缺血GluR2损伤假说”，认为缺血状态下由于GluR2表达降低导致GluR2缺失型AMPA受体生成增多，导致钙透性AMPA受体的增多，从而引发神经元的兴奋性毒性损伤。但该学说有许多未解之谜，如通过CA1区单细胞RT-PCR结合单细胞电生理研究脑缺血并未引发CA1神经元膜上AMPA受体水平与GluR2数目明显降低，Peng等人研究发现只是由于脑缺血引起神经元内2型腺嘌呤脱氨酶酶活性降低，导致非编辑状态GluR2的大量出现，从而导致了钙透性AMPA受体的增多，在CA1区的锥体细胞中GluR2在脑缺血状态下的编辑状态的GluR2在798%之间，以前的发现是由于研究者所采用的CA1整体区域细胞的异源性造成的，非编辑状态的GluR2有利于在组成AMPA受体时形成GluR1、GluR2、GluR3同源多聚体，从而形成的AMPA受体都是致钙透性的。神经细胞内合成的GluR2/3在合成后的膜向转运与树突定向转运依赖一类谷氨酸受体相互作用蛋白即GRIP1（glutamate receptor-interactingprotein GRIP1），及GRIP2（ABP-L）、激酶C反应蛋白（protein interacting withC kinase1, PICK1）等。GRIP1与GRIP2都各有7个PDZ结构域，PDZ结构域在受体的定位、分布及功能上有重要的作用。同样GRIP1与GRIP2能与驱动蛋白（Kinesin）结合，调节神经元树突的物质运输。由于GRIP1与GRIP2不仅能与Kinesin结合影响受体的合成运输，并能与AMPA受体结合调节受体的分布与功能，所以在神经损伤过程当中，GRIP1与GRIP2可能起着重要的作用，搞清楚在损伤过程中GRIP1与GRIP2的功能变化及作用机制，有可能为寻找相应的损伤拮抗剂并及早抑制神经损伤的进一步发展提供可靠的科学依据，具有较高的临床治疗意义。本研究采用光化学法复制成年大鼠局灶性脑梗塞模型，根据缺血缺氧性脑损伤后的不同时间点将大鼠分为5个组，首先采用免疫组织化学的方法，分别用抗GRIP1与GRIP2抗体对缺血灶局部进行了免疫标记，分析脑缺血后不同时间点缺血半暗带区内两者的表达特征。研究发现：在大鼠脑缺血损伤发生后，损伤灶周围有不同程度的坏死出现，在缺血半暗带区出现GRIP1及GRIP2的阳性标记细胞与神经纤维，损伤后6h和1d组的阳性标记较多，并且紧紧相随于坏死组织前沿，表明在损伤发生后GRIP1与GRIP2表达增强，GRIPs可能参与了脑缺血损伤过程。由于AMPA受体在神经兴奋毒性中的作用以及GRIPs对AMPA受体亚基GluR2与GluR3的调控作用，我们进一步研究了缺血损伤发生后GRIP1、GRIP2与AMPA受体亚基GluR2、GluR3的关系。通过免疫组织化学双标记技术研究，证实了AMPA受体亚基GluR2、GluR3与GRIP1、GRIP2在神经元存在双标记，有明显的共存现象，共存多出现在损伤后6h和1d。进而我们通过蛋白免疫印迹技术对缺血区GRIP1蛋白表达水平与GluR2/3在细胞膜与细胞浆的分布状态进行了研究，研究发现脑缺血导致的GRIP1升高时程与GluR2/3在细胞膜上的含量变化非常吻合，当GRIP1在缺血后6h12h达最高水平时，GluR2/3在细胞膜上的含量也达最高，表明GRIPs的表达升高可能是致使GluR2/3在胞膜上分布升高的原因。同时我们第一次发现了脑缺血能诱导GRIP1、GRIP2在大脑少突胶质细胞上的表达。这些结果均表明GRIP1、GRIP2在缺血缺氧性脑损伤过程中可能扮演重要角色。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 研究内容
• 实验一:大鼠局灶性脑梗塞后GRIP1与GRIP2在缺血半暗带内的表达特征
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二:GRIP1与GRIP2在大鼠脑缺血区表达与AMPA受体的关系及胼胝体表达细胞身份的鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三:大鼠局灶性脑梗塞后缺血区GRIP1表达含量时程变化与GluR2/3的膜锚定关系
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢