论文摘要
人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome,AIDS）的病原体。HIV-1编码3个结构基因和6个调节基因,Tat是其中的正调控蛋白。在没有Tat的情况下,整合的前病毒基因组转录不完全,只有短的转录物生成。细胞质中的Tat转导进入细胞核,与病毒新生RNA的长末端重复序列（Long Terminal Repeat,LTR）的反式激活效应元件（transactivating responsive element , TAR）相互作用,反式激活病毒RNA的转录,使得转录得以持续进行下去,生成完整的mRNA。Tat蛋白还可以分泌到感染的细胞外,发挥旁分泌、促细胞生长、免疫抑制及内化等多方面的效用。Tat蛋白对多种细胞表现出来的这些生物学效应,直接或间接地导致了艾滋病各种并发症,如Kaposi’s肉瘤、艾滋病痴呆（AIDS dementia）以及增加艾滋病患者患癌的可能性等。所以针对Tat蛋白的研究已经成为治疗AIDS的一个新靶点。早期的研究大多使用抗Tat蛋白单克隆抗体（mAbs）以阻断Tat的表达,抑制Tat的生物学活性,从而控制疾病的进展。但由于鼠源性单克隆抗体在人体多次使用后可产生人抗鼠抗体（Human Anti-Mouse Antibody,HAMA）反应,从而限制了其临床使用。单链抗体（single-chain Fv,scFv）的出现明显降低了HAMA反应,并具有分子量小,实体组织穿透力强,血浆半衰期短等优点。我们通过基因工程方法制备了Tat融合蛋白,并利用Tomlison（I+J）半合成噬菌体抗体库筛选出人源性抗Tat蛋白的单链抗体,检测出Tat蛋白的部分免疫学和生物学活性,同时也观察到在细胞外应用抗Tat蛋白scFv抑制了Tat蛋白的生物学效用,为进一步研究通过中和Tat蛋白来抑制HIV复制奠定基础。本文利用人工合成方法合成Tat基因,将该基因连接到PET-32a载体中,构建PET-32a-Tat重组质粒。将该质粒转入E.Coli BL21（DE3）感受态细胞中,得到表达Tat融合蛋白的工程菌,并成功诱导该菌表达出Tat融合蛋白。经过系列纯化过程,获得了纯度在95%以上的Tat融合蛋白。利用Tomlinson （I + J）半合成噬菌体抗体库筛选人源性抗Tat蛋白scFv。根据Tat蛋白的Basic保守区域合成一段短肽（RKKRRQRRR）,以此合成短肽为抗原,按照常规程序进行特异性抗Tat蛋白scFv筛选。经4轮“吸附-洗脱-扩增”,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,PCR鉴定其有完整的插入片段,经基因序列测定并检索kabat数据库,确定所克隆的scFv的轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VHⅢ型。经IPTG诱导表达出目的scFv蛋白,主要以分泌型抗体形式存在。对其表达条件进行优化,分析其最佳表达条件为:1mmol/L IPTG,30℃,pH7.2 ,诱导24h,有利于scFv蛋白的大量表达。采用不同层析方法对细菌分泌的scFv进行纯化,最后我们选择了以下纯化路线:蛋白首先经盐析初步纯化,然后经葡萄球菌蛋白A亲和层析,再经过Chelating-Cu金属鏊和层析进一步纯化。最后,利用透析方法去除目的蛋白中的盐。结果表明,该方法可以使目的蛋白得到非常好的纯化。对纯化的抗Tat蛋白scFv进行ELISA检测表明,scFv蛋白具有与Tat结合的特性。Western blotting实验表明,scFv能与本实验室自制的Tat融合蛋白特异性结合。免疫细胞化学实验表明,Tat蛋白可以主动进入细胞内,存在于细胞膜与细胞核部位。在细胞外使用抗Tat蛋白scFv可以明显抑制Tat蛋白的内化作用。细胞凋亡毒性试验表明,抗Tat蛋白scFv可以有效地抑制Tat蛋白对Jurkat细胞的凋亡毒性作用。并且,该scFv蛋白对EC-304和HeLa细胞没有毒性作用,说明scFv可能对细胞没有毒性作用。我们成功构建了PET-32a-Tat重组质粒,在大肠杆菌获得了高效表达,经系列纯化后,获得了高纯度的Tat融合蛋白。同时利用Tomlison（I+J）半合成噬菌体抗体库成功筛选出一株特异性结合Tat蛋白的scFv,纯化的scFv蛋白具有良好的生物学活性,为抗HIV-Tat scFv的临床应用奠定了基础。