粘虫取食行为候选基因的克隆与表达研究

论文摘要

粘虫Mythimna separata （Walker）隶属于昆虫纲（Insecta）,鳞翅目（Lepidoptera）,夜蛾科（Noctuidae）,是我国典型的季节性迁飞害虫。迁飞是粘虫长期适应多变环境形成的一种行为对策,给农业造成重大损失。因此,粘虫迁飞行为的发生与调控机制的研究一直为研究领域的热点。成虫持续飞行时间和产卵前期的长短是界定粘虫是否迁飞的主要标准。粘虫成虫持续飞行时间与生殖前期的长短受幼虫期营养的获得影响,而幼虫取食行为与饲养密度呈现密度依赖性现象,即在高密度条件下饲养的幼虫取食比低密度条件下饲养的幼虫更积极,消耗食物量更多。因此,开展密度依赖性幼虫取食行为分子机制的研究,是对粘虫迁飞机制研究的一个重要补充,具有重要的理论和实际应用价值。候选基因法为非模式昆虫分子水平的研究提供了捷径。本文对粘虫取食行为候选基因进行克隆和表达量分析,旨在为粘虫取食行为分子机制的研究提供基础资料。本文通过RT-PCR、RACE技术从粘虫脑中克隆获得了PKG、NOS和OAR等三个取食行为候选基因cDNA序列,一个QM基因cDNA序列和一个用于定量研究的内参基因β-actincDNA序列,并对这些基因的核苷酸序列和蛋白序列进行了生物信息学分析；通过荧光实时定量PCR技术对4个虫态的两种不同生活型的粘虫脑中的三个取食行为候选基因及QM基因的mRNA表达水平进行了相对定量研究。研究结果如下：1.粘虫PKG基因全长cDNA序列为2065 bp,包含一个长度为1779 bp的开放阅读框,编码592个氨基酸。起始密码子ATG位于第94～96位核苷酸,终止密码子TAA位于第1870-1872位核苷酸。5′非翻译区的长度为93 bp,3′非翻译区的长度为193 bp。在3′非翻译区中有典型的加尾信号AATAAA,可见17 bp长度的PloyA尾。编码的蛋白质分子量为67.909KDa,理论等电点pI=6.74。同源性分析表明该蛋白与家蚕PKG蛋白相似性高达94.43%。功能基序分析显示该蛋白含有蛋白激酶G的功能结构域特征。因此,可以确定本次克隆所获得序列为粘虫PKG基因的全长cDNA序列,命名为MsPKG并上传GenBank,获得序列号为GQ844298。2.粘虫NOS基因全长cDNA序列为4073 bp,包含一个长度为3336 bp的开放阅读框,编码1111个氨基酸。起始密码子ATG位于第96～98位核苷酸,终止密码子TAG位于第3429-3431位核苷酸。5′非翻译区的长度为95 bp,3′非翻译区的长度为642bp。在3′-UTR中有典型的加尾信号AATAAA,可见16 bp长度的PloyA尾。编码的蛋白质分子量为2.693 06 KDa,理论等电点pI=6.9。同源性分析表明该蛋白与烟草天蛾的NOS蛋白相似性高达73%。功能基序分析显示该蛋白具有一氧化氮合酶的N端氧化酶和C端还原酶的双区功能结构域特征。由此,可确定该序列为粘虫NOS基因的全长序列,命名为MsNOS。基因序列已提交GenBank,登录号为JF502067。3.本次实验获得OAR基因含3′末端的部分cDNA序列长为1397bp。将得到的1397bp核苷酸序列进行翻译得到3条氨基酸序列,分别将其在NCBI上进行同源性搜索,发现有一条氨基酸序列与OAR为同源蛋白。该氨基酸序列与家蚕的OAR蛋白相似性高达88%。因此,可确定该序列为粘虫OAR基因序列,基因序列已提交GenBank,登录号为JF502068。4.粘虫QM基因全长cDNA序列为832 bp包含一个长度为660 bp的开放阅读框,编码219个氨基酸。起始密码子ATG位于第116～118位核苷酸,终止密码子TAA位于第773～775位核苷酸。5′非翻译区的长度为115bp,3′非翻译区的长度为57bp。在3′-UTR中有典型的加尾信号AATAAA,可见19 bp长度的PloyA尾。编码的蛋白质分子量为25.4997 KDa,理论等电点pI=10.03。同源性分析表明该蛋白与家蚕QM蛋白相似性高达98%。功能基序分析显示该蛋白为核糖体L10e蛋白。因此,可以确定本次克隆所获得序列为粘虫QM基因的全长cDNA序列,命名为MsQM并上传GenBank,获得序列号为HM467199。5.粘虫β-actin基因全长cDNA序列为1472 bp,包含一个长为1131 bp开放阅读框,编码一个376氨基酸残基的蛋白质。起始密码子ATG位于第69～71位核苷酸,终止密码子TAA位于第1197-1199位核苷酸。5′非翻译区的长度为68 bp,3′非翻译区的长度为273 bp。在3′-UTR中有典型的加尾信号AATAAA,可见19 bp长度的PloyA尾。蛋白质同源性分析结果发现与家蚕的β-actin蛋白相似性高达98%。功能基序列析显示该蛋白具有actin蛋白家族特征。由此可判定该序列为粘虫β-actin基因的全长序列。基因序列已提交GenBank,登录号为GQ856238。6.以β-actin为内参基因,运用荧光实时定量PCR技术对4个虫态的两种不同生活型粘虫脑部的候选基因及QM基因相对定量分析结果表明,MsPKG基因mRNA在4、5龄幼虫及成虫的两种不同生活型脑内的水平呈显著性差异表达；MsNOS基因mRNA在4个虫态的两种不同生活型脑中表达无显著性差异；OAR基因mRNA在4、5、6等三个虫态的两种不同生活型脑中呈显著差异表达；MsQM基因1nRNA在4个虫态的两种不同生活型脑中表达均无显著性差异表达。QM为非行为基因,表达无显著性差异,而与取食行为相关的三个基因中,PKG和NOS有显著性差异表达,并且PKG和OAR在两个不同生活型的表达情况与已报道的动物的情况相似,说明PKG和OAR可能与粘虫取食行为相关,这种推测还有待进一步证实。本文首次从粘虫脑中成功克隆获得了三个取食行为候选基因、一个QM基因和一个内参基因β-actin的cDNA序列,并将序列上传GenBank;运用定量PCR技术分析了取食行为候选基因及QM在两种生活型粘虫脑中的表达情况。这些研究结果将为深入探讨粘虫的取食行为的分子机制提供了必要的数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 粘虫研究概述
• 1.1.1 粘虫简介
• 1.1.2 我国粘虫研究概况
• 1.1.3 粘虫迁飞机制的研究进展及课题的提出
• 1.1.4 候选基因法简介及实验可行性分析
• 1.2 取食行为候选基因的研究进展
• 1.2.1 PKG基因的研究主要进展
• 1.2.2 NO和NOS基因的研究主要进展
• 1.2.3 章鱼胺及章鱼受体研究主要进展
• 1.3 QM基因主要研究进展
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 第2章 实验方法与材料
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 实验所用主要试剂
• 2.1.4 实验所用溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 总RNA质量鉴定
• 2.2.3 第一链cDNA的合成
• 2.2.4 基因cDNA序列的克隆
• 2.2.5 检测候选基因及QM基因的表达水平
• 第3章 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析
• 3.2.1 粘虫PKG基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析
• 3.2.2 粘虫NOS基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析
• 3.2.3 粘虫OAR基因部分cDNA克隆和序列分析
• 3.2.4 粘虫QM基因全长cDNA序列的克隆和生物信息学分析
• 3.2.5.粘虫β-actin基因全长cDNA序列的克隆和生物信息学分析
• 3.3 候选基因及QM基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 3.3.1 目的基因和内参基因的引物有效性检测
• 3.3.2 粘虫PKG基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 3.3.3 粘虫NOS基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 3.3.4 粘虫OAR基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 3.3.5 粘虫QM基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 总RNA的提取
• 4.2 粘虫PKG基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析
• 4.3 粘虫NOS基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析
• 4.4 粘虫OAR基因部分cDNA克隆和序列分析
• 4.5 粘虫QM基因全长cDNA序列的克隆和生物信息学分析
• 4.6 粘虫β-actin基因全长cDNA序列的克隆和生物信息学分析
• 4.7 候选基因及QM基因在两种生活型粘虫脑中的表达
• 结论
• 参考文献
• 附录:缩写词及中英文对照
• 致谢
• 攻读博士学位期间研究成果