环境污染控制过程高灵敏生物传感技术研究及其检测体系构建

论文摘要

在环境污染控制过程中,污染物的降解大多是通过微生物的相互协同作用完成的,对污染物及参与降解过程的微生物的种群分布、功能活性和代谢产物变化等进行快速、灵敏的追踪、监测与时空分辨,是研究污染物降解过程的重要途径。生物传感技术是一种对待测物实现快速、实时、在线分析检测的新兴技术,它利用生物识别作用对待测的物质进行分析测定,与传统的分析方法相比,具有高灵敏度、高专一性、快速测定、简便易携、适用于复杂体系的实时、在线测定等优点,为环境污染物及其降解过程涉及到的各种生物组分或代谢产物的分析检测提供了一个新的技术平台。系统地构建环境污染控制过程中生物传感技术检测体系,为环境污染控制工作提供及时、准确的生物信息,对于解决环境科学与工程领域的实时、在线监测技术难题,最终实现自动化控制,推动环境检测技术大跨度发展具有重要意义。本文研制了一系列生物传感检测方法,用于环境中痕量污染物及其降解产物等的高灵敏检测,并以堆肥环境体系为例,建立起了一套基于生物传感技术的检测环境复杂系统中的污染物及参与其降解过程的生物酶、微生物种群、功能基因和代谢产物动态变化的新方法体系,克服了传统的分析检测方法在环境污染控制过程实时在线检测等方面的局限性,有利于深入了解整个垃圾堆肥处理过程的微生物学机理,高效指导微生物接种和堆肥工艺革新。论文工作从整体上分为四个部分:第一部分为环境中痕量有毒有害污染物及降解产物的高灵敏生物传感检测技术研究。通过采用二茂铁掺杂电聚合和伴刀豆蛋白A自组装等技术将酶固定在电极表面,构建了抑制型葡萄糖氧化酶传感器和抑制型辣根过氧化物酶传感器,分别用于检测土壤样品中的痕量Cr（VI）和Hg（II）与湘江水中的苯肼,具有灵敏度高、抑制可逆、稳定性和选择性好等优点,获得的Cr（VI）和Hg（II）的检测下限均为0.49μg L-1,苯肼的检测下限为1.7×10-6M,并运用酶传感器实验数据,推导出了辣根过氧化物酶对H2O2、对苯二酚的催化反应以及苯肼对该反应的抑制作用的动力学模型,进行了模型拟合与参数估计;将有机氯农药毒莠定与牛血清蛋白交联制备人工抗原,并注射入新西兰大白兔体内提纯出抗体,研制了一种基于壳聚糖/纳米金复合膜的电化学免疫传感器,用于检测稻米、莴苣和稻田水中的痕量毒莠定,该免疫膜具有很好的选择性,灵敏度高,可批量制作、一次性使用,检测下限为5 ng mL-1 ;利用酚类物质普遍具有的还原性,研制了一种传感晶片,以固定在玻片表面的金纳米颗粒为晶种,运用在酚还原作用下金纳米颗粒催化增长的原理和吸收光谱变化规律,用于好氧发酵液等复杂体系中酚浓度检测,检测下限为7×10-6 M,该方法操作简便,成本低,灵敏度高;还利用漆酶催化邻苯二酚氧化还原反应和磁性颗粒分离技术,研制了一种基于磁性纳米颗粒固定技术的漆酶传感器,可用于检测堆肥复杂系统中的浓度低至7.5×10-7M的痕量邻苯二酚。第二部分着重开展基于生物传感技术的堆肥系统微生物降解酶活性及生物表面活性剂的跟踪监测。堆肥系统中多种酶的活性是检测堆肥腐熟度的重要指标,本文利用电极表面固定化纳米金原位扩增对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化的生物电催化活性,研制了一种新型NADH电化学传感器,响应迅速,灵敏度高,能够在酸性缓冲液中检测浓度低至2.5×10-7M的NADH,3个月内保持检测结果精确;利用在NADH还原作用下Au/Ag核壳型纳米颗粒催化增长的原理和吸收光谱变化规律,研制了一种NADH光学纳米生物传感晶片,检测下限为1.56×10-5M;利用木素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）催化底物的氧化还原反应,研制了一种快速同步检测堆肥中木质素降解酶活的电化学酶传感器,检测样品LiP活性范围为8.1429.79 U L-1,MnP活性范围为0.0851.37 U L-1 ,该方法能够排除堆肥浸出液中浊度和光干扰物质的干扰,较传统的分光光度法更加快速、灵敏和精确,是堆肥系统中快速、低成本的堆肥腐熟度检测技术;堆肥常见微生物铜绿假单胞菌发酵代谢产生的鼠李糖脂是一种可改善堆肥微环境的生物表面活性剂,本文制备了二鼠李糖脂人工抗原和抗体,研制了一种基于3,3’-二氨基联苯胺（DAB）显色的二鼠李糖脂酶联免疫试纸,可用于肉眼检测浓度低至0.05 mg L-1的二鼠李糖脂,该方法简便、快速,可重复性良好。第三部分着重开展基于基因传感技术的堆肥系统微生物种群动态和功能基因的跟踪监测。堆肥中某些高效降解污染物的微生物具有相应的功能基因,LiP是真菌降解木质素的一种关键酶,设计合成了黄孢原毛平格菌lip基因探针,研制了一种夹心式杂交识别lip基因的酶联电流型DNA传感器,结合聚合酶链式反应（PCR）和限制性酶切技术,成功检测了黄孢原毛平格菌的基因组DNA提取样品中的lip基因,检测下限为0.03 nM,该DNA传感器能够有效识别相同长度的错配核酸链样品;纤维二糖水解酶（CBH）是纤维素降解的一种关键酶,设计合成了瑞氏木霉cbh2基因探针,运用纳米金原位扩增技术制备了一种金/硅/铁三层复合型核壳磁性纳米颗粒,研制成竞争式杂交识别cbh2基因的电化学纳米DNA传感器,检测下限达到10-13 M;还将羧基化的多壁碳纳米管-多聚（3,4-乙烯二氧噻吩）复合膜沉积在电极表面,制备了cbh2基因传感器,优化实验参数,进行了扫描电镜（SEM）和电化学表征;细菌的16S rDNA/rRNA基因序列具有高度的保守性,可用于种属特异性鉴定,研制了一种基于分子信标荧光分析的铜绿假单胞菌16S rRNA体外定量检测方法,用于检测总RNA提取样品中的16S rRNA,杂交反应需时约30 min,该方法具有高度的特异性,不受核酸交叉污染,检测前不需要对细菌总RNA进行分离和纯化。第四部分为复杂环境体系污染物及降解性能定量检测的数据解析。由于环境样品组成复杂,干扰物质较多,多种待测组分可能同时存在,给分析监测带来很大的不确定性,本文利用人工神经网络（ANNs）解析信号的优良性能,将人工神经网络和电化学酶传感技术相结合,用于黄孢原毛平革菌接种堆肥中木质素降解酶活性电化学检测及漆酶传感器检测邻苯二酚的定量分析,与线性回归模型相比,该方法更加精确、灵敏、稳健;土壤阳离子交换量（CEC）是土壤保留阳离子营养物质和缓冲污染物能力的重要指标,本文还构建了一种基于径向基函数神经网络的土壤传递函数,用于定量分析不同地区、不同土层的土壤CEC,该复合神经网络模型在大规模数据拟合中具有优越性。

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摘要

Abstract

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附表索引

第1章绪论

1.1 生物传感技术在环境污染物检测中的应用

1.1.1 生物传感技术的原理及其早期发展

1.1.2 生物传感器的分类

1.1.3 生物传感器的制备方法

1.1.4 功能型纳米颗粒在生物传感技术中的应用

1.1.5 用于环境污染物检测的生物传感技术的研究现状

1.2 环境污染控制过程生物传感检测体系的构建

1.2.1 环境污染控制过程中的检测技术研究面临的挑战

1.2.2 堆肥过程中污染物的微生物降解和转化

1.2.3 堆肥过程中纤维素和木质素的微生物降解过程研究

1.2.4 堆肥过程生物传感检测体系的构建

1.3 本文构想

第2章抑制型酶生物传感器的构建及用于重金属和有机污染物的检测

2.1 前言

2.2 抑制型葡萄糖氧化酶传感器检测痕量Cr（VI）和Hg（II）的研究

2.2.1 Cr（VI）和 Hg（II）检测及葡萄糖氧化酶抑制与固定化的研究背景

2.2.2 实验部分

2.2.3 结果与讨论

2.3 抑制型辣根过氧化物酶传感器检测苯肼及其催化与抑制动力学研究

2.3.1 苯肼检测及辣根过氧化物酶抑制与固定化的研究背景

2.3.2 实验部分

2.3.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章一次性免疫抗体膜的制备及用于农药毒莠定的免疫传感检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂

3.2.2 仪器

3.2.3 毒莠定-BSA 偶联体制备

3.2.4 免疫实验和抗血清采集

3.2.5 免疫扩散实验

3.2.6 ELISA 实验

3.2.7 抗血清纯化

3.2.8 免疫膜制备

3.2.9 膜免疫反应和电化学检测

3.2.10 环境样品中毒莠定的浸提

3.2.11 安全注意事项

3.3 结果与讨论

3.3.1 抗血清分析

3.3.2 免疫膜形态分析

3.3.3 免疫传感器酶反应的电化学行为分析

3.3.4 检测体系优化

3.3.5 免疫反应步骤优化

3.3.6 免疫传感器检测毒莠定

3.3.7 样品毒莠定检测

3.3.8 特异性和稳定性

3.4 小结

第4章固定化纳米金原位催化扩增技术用于酚的光学检测

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂

4.2.2 仪器

4.2.3 纳米传感晶片制备

4.2.4 对苯二酚检测

4.2.5 黄孢原毛平革菌好氧发酵液制备

4.3 结果与讨论

4.3.1 固定化Au NPs 原位催化增长的特性分析

4.3.2 检测条件优化

4.3.3 对苯二酚检测

4.3.4 发酵液中酚回收实验

4.4 小结

第5章堆肥过程中微生物降解酶活性的传感检测

5.1 前言

5.2 固定化纳米金原位催化扩增技术用于NADH 的电化学检测

5.2.1 NADH 电化学检测及固定化纳米金原位催化扩增研究背景

5.2.2 实验部分

5.2.3 结果与讨论

5.3 固定化 Au

5.3.1 NADH 光学检测及核壳型纳米颗粒原位催化扩增研究背景

5.3.2 实验部分

5.3.3 结果与讨论

5.4 小结

第6章斑点酶联免疫试纸技术用于堆肥过程生物表面活性剂鼠李糖脂的检测

6.1 前言

6.2 实验部分

6.2.1 试剂

6.2.2 仪器

6.2.3 微生物培养和鼠李糖脂提取

6.2.4 二鼠李糖脂-BSA 偶联体制备

6.2.5 免疫实验和抗血清采集与纯化

6.2.6 免疫扩散实验

6.2.7 ELISA 实验

6.2.8 免疫试纸制备

6.2.9 鼠李糖脂检测

6.3 结果与讨论

6.3.1 二鼠李糖脂-BSA 偶联体的核磁共振分析

6.3.2 抗血清效价分析

6.3.3 抗血清特异性分析

6.3.4 检测条件优化

6.3.5 二鼠李糖脂免疫试纸敏感性试验

6.4 小结

第7章 DNA 传感器用于堆肥木质素降解功能基因的高灵敏检测

7.1 前言

7.2 实验部分

7.2.1 试剂

7.2.2 寡核苷酸探针、引物和目标链设计

7.2.3 仪器

7.2.4 微生物培养和基因提取

7.2.5 PCR 扩增和限制性酶切

7.2.6 传感器制备

7.2.7 杂交和检测

7.3 结果与讨论

7.3.1 金电极表面寡核苷酸探针的电化学表征

7.3.2 自组装和杂交条件优化

7.3.3 DNA 传感器检测合成寡核苷酸的性能

7.3.4 DNA 检测选择性

7.3.5 凝胶电泳分析

7.3.6 基因片段检测

7.4 小结

第8章 DNA 传感器用于堆肥纤维素降解功能基因的高灵敏检测

8.1 前言

8.2 金/硅/铁三层磁性核壳纳米颗粒用于纤维二糖水解酶 II 型编码基因分离和超灵敏检测

8.2.1 复合型磁性核壳纳米颗粒用于基因检测的研究背景和思路

8.2.2 实验部分

8.2.3 结果与讨论

8.3 多壁碳纳米管-高分子导电聚合物复合膜用于纤维二糖水解酶II 型编码基因检测

8.3.1 碳纳米管-高分子导电聚合物复合膜用于基因检测的研究思路

8.3.2 实验部分

8.3.3 结果与讨论

8.4 小结

第9章分子信标技术用于堆肥微生物铜绿假单胞菌165 rRNA 序列检测

9.1 前言

9.2 实验部分

9.2.1 试剂

9.2.2 分子信标的设计与合成

9.2.3 仪器

9.2.4 铜绿假单胞菌菌种培养及RNA 提取

9.2.5 分子信标性能检测

9.2.6 铜绿假单胞菌总RNA 分析及165 rRNA 检测

9.2.7 注意事项

9.3 结果与讨论

9.3.1 分子信标性能的测试

9.3.2 标准曲线的绘制

9.3.3 提取的铜绿假单胞菌总RNA 纯度分析

9.3.4 铜绿假单胞菌165 rRNA 的检测

9.3.5 铜绿假单胞菌165 rRNA 检测条件的优化

9.4 小结

第10章复杂环境体系污染物及降解性能定量检测的数据解析

10.1 前言

10.2 堆肥系统中的木质素降解酶活的电化学同步检测与多元线性回归、人工神经网络数据解析

10.2.1 木质素降解酶活测定的研究背景及电化学同步检测酶活的研究思路

10.2.2 实验部分

10.2.3 结果与讨论

10.3 基于磁性纳米颗粒固定技术的漆酶传感器检测堆肥中的邻苯二酚与人工神经网络数据解析

10.3.1 酚类污染物检测的研究背景及漆酶传感器与人工神经网络模型的构建思路

10.3.2 实验部分

10.3.3 结果与讨论

10.4 土壤阳离子交换量的定量分析与人工神经网络数据解析

10.4.1 土壤阳离子交换量的研究背景及人工神经网络模型的构建思路

10.4.2 实验部分

10.4.3 结果与讨论

10.5 小结

结论

参考文献

致谢

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录 B 攻读学位期间所发表的著作目录

附录 C 攻读学位期间所获奖励及专利情况

附录 D 攻读学位期间所承担或参与的科研项目情况

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